Calc dag failed: Calc DAG failed! | MiningClub.info

Поскольку пандемия продолжает отражаться в нашем зеркале заднего вида, мы переходим к подходу, основанному на инновациях, в котором

Наша программа «Часы инноваций» дает нашим сотрудникам время для работы над своими интересными проектами каждую неделю.В составе

Grokking Streaming Systems разрабатывалась последние два года, и теперь эта книга - шаг

Нерешительность может взять верх над нами во время игры. но Legends of Runeterra Play Around Helper был разработан

Стимуляция RasGRP1 сложным эфиром форбола регулирует котранспортер хлорида натрия с помощью PKC-независимого пути

Аннотация

Котранспортер хлорида натрия (NCC) является основным путем абсорбции солей в дистальных извитых канальцах (DCT) млекопитающих и является местом действия одного из наиболее эффективных классов антигипертензивных препаратов, тиазидных диуретиков.Мы разработали систему клеточной модели для оценки функции NCC в линии клеток млекопитающих, которая изначально экспрессирует NCC, линию клеток мыши DCT (mDCT). Мы использовали эту систему для изучения комплексной регуляции NCC с помощью сложного эфира форбола (PE) 12- O -тетрадеканоилфорбол-13-ацетат (TPA), аналог диацилглицерина (DAG). Обычно считалось, что PE опосредуют свое действие на транспортеры через активацию PKC. Однако есть как минимум пять других целей DAG / PE. Здесь мы описываем, как одна из этих альтернативных мишеней эффектов DAG / PE, Ras-гуанил-высвобождающий белок 1 (RasGRP1), опосредует PE-индуцированное подавление функции и поверхностную экспрессию NCC.Функциональная оценка NCC с использованием тиазид-чувствительных захватов ²² Na ⁺ показала, что TPA полностью подавляет функцию NCC. Эксперименты по биотинилированию продемонстрировали, что этот результат был в первую очередь из-за снижения поверхностной экспрессии NCC. Хотя ингибиторы PKC не влияли на это подавление, ингибиторы MAPK полностью предотвращали эффект TPA. RasGRP1 активирует путь MAPK посредством активации малого G-белка Ras. Подавление гена RasGRP1 предотвращает опосредованное PE подавление активности NCC, активацию изоформы H-Ras Ras и активацию ERK1 / 2 MAPK.Это открытие подтвердило критическую роль RasGRP1 в опосредовании PE-индуцированного подавления активности NCC посредством стимуляции пути MAPK.

Тиазид-чувствительный котранспортер хлорида натрия (NCC) - это путь поглощения соли, расположенный на апикальной мембране дистального извитого канальца (DCT) млекопитающих, который отвечает за реабсорбцию 5–10% отфильтрованной нагрузки натрия (1). ). Теперь, через 50 лет после введения первого тиазидного диуретика, фармакологическое ингибирование NCC тиазидными диуретиками рекомендуется в качестве терапии первой линии при эссенциальной гипертензии (2).Также было показано, что NCC играет роль в генетических нарушениях гипотонии и гипертензии (3–6). Несмотря на важность этого котранспортера при заболеваниях человека, механизмы, лежащие в основе регуляции этого котранспортера в почках млекопитающих, остаются в значительной степени неизвестными. Относительная сложность выделения DCT для исследований микроперфузии и отсутствие линии клеток DCT млекопитающих, которая поддается физиологическим исследованиям, были основными препятствиями для изучения регуляции этого котранспортера.Используя золотой стандарт для оценки активности NCC, тиазид-чувствительного захвата ²² Na ⁺ , мы разработали метод исследования регуляции этого котранспортера в линии клеток млекопитающих, которая экспрессирует его в естественных условиях.

Эта система позволила нам оценить комплексную регуляцию NCC с помощью сложных эфиров форбола (PE), функциональных аналогов диацилглицерина (DAG). В течение многих лет считалось, что DAG и PE опосредуют свои эффекты строго через стимуляцию PKC.Классический путь G-белкового рецептора (GPCR), стимулирующий фосфолипазу C (PLC), приводящий к высвобождению DAG и стимуляции PKC, был принятым путем для DAG-зависимой регуляции. Однако за последние несколько лет стало очевидно, что PE (и DAG) могут связывать и активировать по крайней мере пять других семейств мишеней DAG, таких как Munc 13s, киназы DAG, химерины, протеинкиназы D (PKD) и Ras. гуаниловые нуклеотид-высвобождающие белки (RasGRP) (7). Все эти семейства белков, а также PKC, как было показано, связывают DAG / PE через структурно подобный DAG-связывающий домен, домен C1 (7).Однако в литературе по физиологии влияние этих других мишеней DAG / PE в значительной степени недооценивается. Фактически, насколько нам известно, не было ни одного исследования, в котором изучались бы, опосредованы ли эффекты DAG / PE на транспортеры или каналы другими мишенями, кроме PKC или PKD (которые первоначально назывались PKCμ). Эффект и влияние этих других партнеров по связыванию были дополнительно замаскированы использованием старых, неспецифических ингибиторов PKC, таких как Calphostin C (CalC), который ингибирует всех партнеров связывания DAG.Учитывая большое количество литературы по физиологии транспорта, в которой эффекты DAG / PE приписываются PKC, последствия этих открытий могут потребовать от нас пересмотра всей исторической литературы по физиологии регуляции PKC каналов и транспортеров. Здесь мы описываем, что RasGRP1, а не PKC, является мишенью DAG / PE, которая опосредует подавление NCC.

Результаты

клетки mDCT изначально проявляют активность NCC.

Чтобы оценить влияние стимуляции DAG / PE на активность NCC, в наших экспериментах мы использовали клетки DCT [mDCT, подарок Питера Фридмана (Университет Питтсбурга, Питтсбург, Пенсильвания)].Эти клетки демонстрируют транспортные характеристики, соответствующие клеткам из второй части DCT мыши и человека, включая экспрессию белка NCC, чувствительное к амилориду поглощение натрия и чувствительное к тиазидам поглощение натрия (8, 9). Однако протоколы захвата ²² Na ⁺ , использованные в этих исследованиях, включали определение поглощения радиоактивных индикаторов, когда клетки мДСТ находились в суспензии (9). Чтобы устранить любые артефакты из-за воздействия трипсина и более точно имитировать физиологические условия, мы разработали протокол для измерения активности NCC клеток мДСТ, выращенных в монослое.Используя этот протокол, клетки mDCT продемонстрировали значительное поглощение ²² Na ⁺ , чувствительное к тиазидам, что определяется разницей между поглощением ²² Na ⁺ клеток mDCT, подвергнутых воздействию сред, не содержащих тиазидов и содержащих тиазиды. Чтобы убедиться, что поглощение этого тиазид-чувствительного радиоактивного индикатора представляет активность NCC, аналогичные исследования были проведены с использованием не содержащих хлоридов и содержащих хлорид сред для поглощения и показали значительное хлоридзависимое поглощение ²² Na ⁺ , которое можно было ингибировать добавлением возрастающих концентраций тиазида (рис.1 А ). Этот эффект был значительным при таких низких концентрациях метолазона, как 1 × 10 ^-6 М. Точно так же чувствительное к тиазиду поглощение зависело от присутствия хлорида в среде для поглощения (рис. 1). В ). Кроме того, добавление амилорида, бензамила и буметанида для ингибирования захвата натрия эпителиальным натриевым каналом (ENaC), обменником Na ⁺ / Ca ⁺ (NCX1) и Na ⁺ K ⁺ 2Cl ^{- Котранспортер} (NKCC1), соответственно, существенно не изменял хлор-зависимое поглощение радиоактивного индикатора натрия (данные не показаны).Эти исследования показывают, что клетки mDCT демонстрируют поглощение ²² Na ⁺ , которое является как тиазид-чувствительным, так и хлорид-зависимым, что является отличительным признаком активности NCC. Поскольку эта активность присуща клеткам mDCT, эти клетки предоставили возможность изучить эффект DAG / PE в системе с внутренней функцией NCC и регуляторными механизмами.

Хлорид-зависимый и тиазид-чувствительный ²² Na ⁺ Поглощение мДСТ клетками. ( A ) клетки mDCT предварительно инкубировали в среде, не содержащей хлоридов, а затем инкубировали в течение 20 мин либо в среде, не содержащей хлора, либо в содержащей хлорид среде для поглощения и увеличивающихся концентрациях метолазона ( n = 8). *, P <0,01 по сравнению с носителем. ( B ) Клетки mDCT, предварительно инкубированные в среде, не содержащей хлора, инкубировали в среде, не содержащей хлоридов (без Cl) или содержащей хлорид (с Cl), и либо в носителе, либо в 1 мМ метолазоне.Поглощение, чувствительное к тиазидам, рассчитывали как разницу в поглощении радиоактивных индикаторов между группами, содержащими метолазон, и группами, не содержащими метолазон ( n = 8). *, P <0,01 по сравнению с группой, содержащей хлорид.

12-

Первоначальные исследования по оценке влияния DAG / PE на функцию NCC были выполнены с использованием системы экспрессии ооцитов Xenopus laevis . ²² захвата Na ⁺ , проведенного на ооцитах, экспрессирующих NCC, показали снижение активности NCC при обработке PE TPA по сравнению с носителем (рис. А ). Чтобы оценить влияние TPA на нашу клеточную систему млекопитающих, было проведено ²² захвата Na ⁺ клетками mDCT в присутствии форсколина (активатора PKA), TPA или функционально неактивного сложного эфира форбола 4-α-форбола 12, 13-дидеканоат (4α-PDD). Добавление 100 нМ TPA в течение 15 минут устраняет поглощение, чувствительное к тиазидам, снижая поглощение до статистически не отличного от нуля для TPA по сравнению с 43.4 ± 8,68 нмоль / мг для носителя ( P <0,01 по ANOVA) (рис. 2 В ). Обработка клеток 4α-PDD или форсколином существенно не влияла на функцию NCC по сравнению с контролем. Эти данные указывают на то, что PE действуют как мощные супрессоры функции NCC.

Ингибирование активности NCC TPA.( A ) ²² Na ⁺ поглощение ооцитов X. laevis , инъецированных либо водой (H ₂ O), либо кРНК для NCC крысы (NCC крысы) и обработанных 100 мкМ метолазона (M), 1 мкМ TPA (T) или носитель DMSO (C). Данные по поглощениям, выполненным с использованием среды поглощения с хлоридом (NC), включены в качестве отрицательного контроля ( n = 38). *, P <0,01, по сравнению с контрольной рНКР. ( B ) ²² Na ^{+ Поглощение} клеток mDCT, обработанных 150 нМ форсколином (FSK), 100 нМ TPA, 100 нМ 4α-PDD (PDD) или контролем (носитель DMSO, C) перед помещением в среда усвоения ( n = 12).*, P <0,01 по сравнению с ДМСО. ( C ) Поверхностные белки клеток mDCT, обработанных как в B , были биотинилированы. Показаны иммуноблоттинг и денситометрия для общего лизатного белка NCC и поверхностного биотинилированного NCC в каждой группе ( n = 10). Полоса NCC появляется при 110 кДа. *, P <0,001, по сравнению с контрольной группой и группами PDD.

TPA снижает экспрессию поверхности NCC.

Активность NCC может регулироваться изменением либо его поверхностной экспрессии, либо внутренней функции котранспортера.Чтобы изучить роль первого в нашей клеточной системе, эксперименты по биотинилированию клеточной поверхности были выполнены на клетках mDCT, инкубированных с носителем, TPA или 4α-PDD. Количество общего белка NCC в клеточном лизате было одинаковым в каждой группе (рис. С ). TPA значительно снижает экспрессию NCC на поверхности клеток mDCT, тогда как 4α-PDD не оказывает значительного влияния на экспрессию NCC на поверхности. Это уменьшение поверхностной экспрессии на ≈68% предполагает, что большая часть снижения активности, наблюдаемого при воздействии ТРА, опосредована изменениями в поверхностной экспрессии.

Влияние TPA на активность NCC опосредуется RasGRP1.

Для определения пути, посредством которого TPA оказывает свое влияние на NCC, было выполнено ²² захвата Na ⁺ с TPA в присутствии различных ингибиторов. Ни один из ингибиторов сам по себе не влиял на функцию NCC (данные не показаны). Лечение бисиндолилмалеимидом (BIM), ингибитором классических и новых изоформ PKC, не устраняет влияние TPA на активность NCC ни в клетках mDCT, ни в клетках X.laevis ооцитов [рис. 3 A и вспомогательная информация (SI) Рис. 8]. Точно так же Gö6976, классический ингибитор PKC, который также блокирует действие PKD, не изменил влияние TPA на активность NCC. Взятые вместе, эти данные предполагают, что эффект TPA был не из-за стимуляции изоформы PKC или PKD и что TPA действовал путем связывания с другим медиатором, который разделял C1-связывающий домен. Поэтому клетки обрабатывали CalC, который блокирует домен C1.Как и ожидалось, добавление CalC предотвращало любое снижение активности NCC в ответ на TPA (42,2 ± 5,7 нмоль / мг для CalC с TPA по сравнению с отсутствием отличий от нуля для одного TPA) (рис. А ).

Активность и поверхностная экспрессия NCC под воздействием ТРА и различных ингибиторов. ( A ) ²² Na ^{+ Поглощение} мДСТ клетками, обработанными 100 нМ TPA (T) или 250 нМ BIM (B + T), 200 нМ CalC (C + T), 500 нМ Gö6976 (G + T), 10 нМ U0126 (U + T), 10 нМ SB203408 (S + T) или контроль (носитель ДМСО, C) перед помещением в среду для поглощения ( n = 8).*, P <0,005, по сравнению с одним TPA. ( B ) Клетки, обработанные 100 нМ TPA (T) и 10 нМ U0126 (U), биотинилировали и проводили иммуноблоттинг на NCC. Полоса NCC появляется при 110 кДа. *, P <0,05, по сравнению с контролем.

Семейство белков RasGRP активируется DAG доменом C1 и активирует небольшой G-белок Ras, удаляя GDP из неактивного RasGDP и позволяя GTP связываться с Ras, образуя активный RasGTP.RasGTP в конечном итоге приводит к активации MAPK, запускающей Raf-1, MEK1 / 2 (MAP и ERK киназа 1/2) и, наконец, активация ERK1 / 2 MAPK (регулируемые внеклеточными сигналами киназы 1 и 2). Учитывая этот сигнальный путь и тот факт, что RasGRP1 экспрессируется в дистальных канальцах почек млекопитающих (10), мы предположили, что RasGRP1 был партнером по связыванию TPA. Чтобы проверить эту гипотезу, мы заблокировали нижестоящие мишени активации Ras и обнаружили, что обработка как TPA, так и 1,4-диамино-2,3-дициано-1,4-бис [2-аминофенилтио] бутадиена (U0126), очень селективный ингибитор MEK1 / 2, сводящий на нет действие ТРА (62.9 ± 6,3 нмоль / мг для U0126 и TPA по сравнению со статистически значимым отличием от нуля для одного TPA) (рис. А ). Этот эффект был специфическим для инактивации MEK1 / 2, поскольку SB203580, ингибитор киназы p38 MAPK, не оказывал значительного влияния на TPA-индуцированное подавление активности NCC. Зависимость MEK1 / 2 от эффекта TPA также наблюдалась при поверхностной экспрессии NCC, поскольку эксперименты по биотинилированию показали, что добавление U0126 отменяет снижение поверхностной экспрессии, наблюдаемое при использовании только TPA (рис.3 В ).

Поскольку блокада MEK1 / 2 и, следовательно, ERK1 / 2 MAPK, предотвращает эффект DAG / PE, мы непосредственно исследовали роль RasGRP1 в этом процессе. Как и ожидалось, RasGRP1 четко экспрессируется в клетках mDCT, что видно с помощью иммунопреципитации и последующего вестерн-блоттинга, а также с помощью RT-PCR мРНК, собранной из клеток mDCT (SI фиг. 9).

Чтобы оценить роль RasGRP1 в эффекте TPA на NCC, клетки mDCT трансфицировали siRNA для RasGRP1.Молчание генов было подтверждено вестерн-блоттингом и продемонстрировало снижение экспрессии на 66% по сравнению с контролем (фиг. 4). А ). ²² захвата Na ⁺ проводили в присутствии ТРА параллельно. Клетки, трансфицированные нецелевой миРНК, не отличались от контроля, не получавшего миРНК, в отношении средней активности NCC и ответа на ТРА (рис. 4). В ). Подавление гена для RasGRP1 полностью предотвращало влияние TPA на поглощение натрия, потому что эти клетки демонстрировали аналогичные уровни активности NCC в присутствии или в отсутствие TPA (43.7 ± 1,7 против 46,8 ± 3,6 нмоль / мг) (рис. В ). Активность NCC клеток, трансфицированных siRNA для RasGRP1, при обработке TPA была значительно выше, чем аналогичным образом обработанные контрольные и нецелевые группы (46,8 ± 3,6 нмоль / мг по сравнению со статистически не отличавшейся от нуля для контрольной и нецелевой групп) (рис. В ). Это открытие указывает на то, что эффект DAG / PE опосредуется RasGRP1.

Активность NCC после подавления гена RasGRP1. ( A ) клетки mDCT трансфицировали siRNA для RasGRP1 (siRG), нецелевую siRNA (NT) или пустой вектор (C). Клетки лизировали через 48 часов после трансфекции и проводили иммунопреципитацию и иммуноблоттинг с антителом против RasGRP1 ( n = 5 для сопутствующей денситометрии). *, P <0,01 по сравнению с C и NT. ( B ) ²² Na ⁺ . Эксперименты по поглощению проводили на аналогичным образом трансфицированных клетках, обработанных 100 нМ TPA (T) или носителем (DMSO) ( n = 12).*, P <0,05, по сравнению с C + T или NT + T.

ТРА-индуцированная стимуляция RasGRP1 активирует H-Ras.

Чтобы подтвердить это открытие, мы исследовали влияние TPA на сайт действия RasGRP1, Ras. Исследования были проведены с использованием анализа активированного Ras pull-down на лизатах клеток мДСТ, обработанных либо ненаправленной siRNA, либо siRNA, специфичной для RasGRP1. Было обнаружено, что TPA увеличивает общий Ras-GTP на 16,0 ± 1,5% ( P <0.05) (Рис.5 А ). Общий RasGTP в клетках mDCT с молчанием RasGRP1 был значительно снижен на 27,3 ± 6,9% по сравнению с контролем ( P <0,05). Примечательно, что существует три основных изоформы Ras (H-Ras, K-Ras и N-Ras), и описана предпочтительная активация определенных изоформ различными эффекторами (11). Учитывая несоответствие между величиной увеличения уровней RasGTP и резким снижением активности NCC, мы поэтому исследовали паттерны активации Ras каждой из этих изоформ Ras.Увеличение RasGTP с TPA было полностью из-за увеличения H-Ras-GTP, поскольку анализы активированного Ras pull-down, проведенные с использованием изотип-специфичных антител, показали увеличение H-Ras-GTP на 32,7 ± 4,5% ( P <0,01). при воздействии ТПА (рис. 5 В ). Подавление RasGRP1 с помощью siRNA значительно снижает уровни H-Ras-GTP на 90,5 ± 2,1% по сравнению с контролем ( P <0,01) (рис. В ). Не наблюдалось значительного изменения уровней H-Ras-GTP в RasGRP1-молчащих клетках mDCT, обработанных TPA.N-Ras и K-Ras не показали изменений в активации с помощью TPA или сайленсинга генов (рис. 5). В ). Эти эксперименты демонстрируют, что стимуляция RasGRP1 TPA ​​в этой системе специфически и значительно активирует H-Ras.

Активация Ras в клетках мДСТ после подавления гена RasGRP1.Клетки mDCT, трансфицированные siRNA для RasGRP1 (siRG) или не нацеливающей siRNA (NT), предварительно инкубировали в среде, не содержащей хлоридов, а затем обрабатывали в течение дополнительных 15 мин 100 нМ TPA или носителем (DMSO). Затем клетки лизировали и проводили анализ RasGTP с последующим иммуноблоттингом на Ras (21 кДа). Показаны репрезентативные иммуноблоты и денситометрии. ( A ) Ras (все изоформы) ( n = 4). * и #, P <0,01 по сравнению с NT. ( B ) H-, K- и N-Ras ( n = 4).*, P <0,01 по сравнению с NT.

RasGRP1 опосредует активацию ERK1 / 2 с помощью TPA.

Чтобы оценить влияние TPA-опосредованной стимуляции RasGRP1 на активацию ERK1 / 2 MAPK, мы исследовали уровни активированной ERK1 / 2 с использованием антитела, специфичного для активной фосфорилированной ERK1 / 2. Клетки снова обрабатывали либо нецелевой миРНК, либо миРНК, специфичной для RasGRP1, перед лизисом и иммуноблоттингом. Добавление TPA значительно увеличивало фосфорилированный ERK1 / 2 на 209 ± 27% по сравнению с контролем ( P <0.005) (рис.6). Примечательно, что уровни фосфорилирования ERK1 / 2 в клетках mDCT, обработанных siRNA для RasGRP1, существенно не отличались от контроля, предполагая, что базальные уровни фосфорилирования ERK1 / 2 поддерживаются другими механизмами. Добавление TPA в эти клетки с нокдауном RasGRP1 не оказало значительного влияния на уровни фосфорилированного ERK1 / 2 по сравнению с контролем. Взятые вместе, эти данные показывают, что PE-индуцированная активация RasGRP1 / H-Ras ответственна за повышенную активацию ERK1 / 2 MAPK, которая опосредует снижение экспрессии NCC на поверхности клеток и снижение функции NCC.

Фосфорилирование ERK в клетках mDCT после подавления гена RasGRP1. Клетки mDCT, трансфицированные siRNA для RasGRP1 (siRG) или нецелевой siRNA (NT), обрабатывали в течение 15 мин 100 нМ TPA или носителем (DMSO). Затем клетки лизировали и проводили иммуноблоттинг на фосфорилированную или общую ERK1 / 2. ERK1 появляется при 44 кДа, а ERK2 появляется при 42 кДа ( n = 4).*, P <0,01 по сравнению с NT.

Обсуждение

Подавляющее большинство работ по регуляции NCC было выполнено в гетерологичных системах экспрессии. Используя систему экспрессии ооцитов X. laevis , мы обнаружили, что PE являются мощными супрессорами активности NCC (рис. 2). А ). Однако в исследовании (12), посвященном регуляции NCC с использованием клеток происхождения собирательного протока, трансфицированных человеческим NCC, сообщается, что PE не влияют на поглощение тиазид-чувствительного ²² Na ⁺ .Мы создали метод для надежного измерения функции NCC в физиологически релевантной клеточной системе, которая изначально экспрессирует NCC. Исследование сложной регуляции NCC с помощью DAG / PE с использованием этой системы продемонстрировало подавление NCC и выявило новый регуляторный путь физиологических эффектов DAG / PE на транспортные белки. Учитывая хорошо описанную гетерогенность гормонального ответа, эффекторов и вторичных мессенджеров между различными сегментами нефрона (13), гетерологичная экспрессия NCC в клетках происхождения собирательного протока могла сыграть роль в противоречивых результатах.

Хотя DAG исторически был связан с активацией PKC в качестве единственного медиатора его эффектов, существует по крайней мере пять других семейств белков (включая RasGRP), которые связываются и активируются DAG и PE (7, 14). Используя специфические ингибиторы PKC и PKD, мы смогли продемонстрировать, что эти мишени DAG не участвуют в подавлении NCC с помощью PE. Поскольку один из членов семейства белков RasGRP (RasGRP1) экспрессируется в дистальных канальцах почек млекопитающих (10), мы исследовали, опосредует ли он эффект PE.Семейство малых G-белков RasGRP также включает RasGRP2, -3 и -4. RasGRP1 и -3 представляют собой высокоаффинные связывающие DAG (15, 16), которые участвуют в контроле клеточной дифференцировки и пролиферации, особенно в T- и B-клетках (17, 18). Они также, по-видимому, играют ключевую регуляторную роль в кератиноцитах и ​​нейроэндокринных клетках (19, 20). Путь активации DAG / PE RasGRP сложен и специфичен для клетки. В некоторых клетках активация RasGRP с помощью PE, по-видимому, опосредуется через PKC (21, 22).В других клетках DAG / PE-стимуляция RasGRP не зависит от PKC (19, 20). После активации DAG, RasGRP1 активирует малый G-белок Ras, вызывая высвобождение GDP из Ras. Затем Ras может свободно связываться и активироваться GTP (рис. 7). Существует три изоформы Ras (H-Ras, K-Ras и N-Ras). Ras активирует Raf, первую киназу в пути ERK1 / 2 MAPK. Затем Raf фосфорилирует и активирует MEK1 / 2, который фосфорилирует и активирует ERK1 / 2. Этот каскад киназ Ras / Raf / MEK / ERK хорошо охарактеризован и играет роль во многих клеточных процессах.Присутствие RasGRP1 в дистальных канальцах млекопитающих и клетках mDCT, а также полное предотвращение PE супрессии NCC с помощью ERK1 / 2 MAPK блокады (рис. 3) предполагают, что RasGRP1 может быть медиатором эффекта PE. Специфичность пути ERK1 / 2 MAPK для ингибирования NCC подчеркивается полным отсутствием действия ингибиторов PKC, PKD и p38 MAPK (рис. 3). Единственным другим ингибитором, который блокировал этот эффект, был CalC, который подавляет все мишени DAG. Подтверждение критической роли RasGRP1 было продемонстрировано устранением подавления PE NCC с помощью нокдауна RasGRP1.

Предлагаемый механизм действия DAG / PE на NCC в клетках mDCT. GPCR, рецептор, связанный с G-белком; L, лиганд; PLC, фосфолипаза C; ДАГ, диацилглицерин; RasGRP1, Ras-высвобождающий гуанил белок 1; Киназа 1/2 MEK, MAP и ERK; ERK, регулируемые внеклеточными сигналами киназы 1 и 2.

Мы также исследовали эффекты на непосредственный нижестоящий эффектор RasGRP1, Ras.Снижение активации Ras соответствовало нокдауну RasGRP1 (фиг. 5). Однако, поскольку степень нокдауна RasGRP1 оказывается выше, чем снижение активации Ras, это открытие может отражать снижение активации конкретной изоформы или изоформ Ras, тогда как состояние активации других изоформ Ras не изменяется. Есть некоторые свидетельства того, что изоформы Ras могут предпочтительно активироваться при определенных условиях. В Т-клетках Jurkat слабая стимуляция преимущественно активирует N-Ras, тогда как более интенсивная стимуляция активирует как K-Ras, так и N-Ras (клетки Jurkat эндогенно экспрессируют небольшое количество H-Ras) (11, 23).Этот эффект был приписан дифференциальной клеточной локализации, при этом N-Ras и H-Ras, способные активироваться в Golgi и K-Ras, активируются только на плазматической мембране (23, 24). Однако другие исследования с использованием других репортерных систем и условий не смогли найти эту предпочтительную локализацию (25, 26). Учитывая гетерогенность экспрессии и стимуляции, специфичных для изоформ Ras, мы проверили, активирует ли RasGRP1 преимущественно определенные изоформы Ras. Это открытие показало, что PE, по-видимому, предпочтительно активируют H-Ras, и что базальная и стимулированная PE активация H-Ras зависит от RasGRP1 (рис.5). Другие изоформы Ras не активируются PE и не зависят от RasGRP1.

Изучение эффекта сайленсинга RasGRP1 на активацию ERK1 / 2 дает дополнительное понимание этого процесса. Ожидаемое значительное увеличение активации ERK1 / 2 при воздействии PE присутствует, и подавление экспрессии RasGRP1 явно предотвращает эту активацию (фиг. 6). Однако существует базальный уровень активации ERK1 / 2, на который не влияет подавление экспрессии RasGRP1.Этот независимый от RasGRP1 базальный уровень активации ERK1 / 2 хорошо коррелирует с независимой от RasGRP1 базальной активацией K-Ras и N-Ras. Таким образом, активация N-Ras и K-Ras посредством пути не-PE, не-RasGRP1 может потенциально опосредовать базальную активацию ERK1 / 2. Существует ряд белков, которые не являются DAG / PE-стимулированными белками, которые активируют Ras. Один из этих белков может опосредовать базальную активацию ERK через N-Ras и K-Ras, тогда как RasGRP1 опосредует стимулированную PE активацию H-Ras и ERK, которая регулирует поверхностную экспрессию NCC.

Подавление функции NCC, опосредованной TPA, по-видимому, в первую очередь из-за снижения поверхностной экспрессии (рис. 2 и 3), которая зависит от MAPK. Острые изменения поверхностной экспрессии являются хорошо установленным регуляторным механизмом для транспортных белков. В настоящее время единственным установленным механизмом регуляции поверхностной экспрессии NCC является ингибирование WNK4 прямого транспорта NCC (27, 28). Этот процесс не включает динамин-зависимый эндоцитоз и может включать изменения в деградации лизосом до встраивания плазматической мембраны.Однако существует множество примеров регуляции транспортных белков посредством динамин-зависимого эндоцитоза. MAPKs также, как было показано, опосредуют изменения в поверхностной экспрессии белков транспорта ионов (29-31). Путь RasGRP1 / MAPK может регулировать эндоцитотический путь в NCC, обеспечивая путь для регуляции поверхностной экспрессии NCC, отличный от эффектов WNK4 на NCC. Необходимо дальнейшее выяснение механизмов, обеспечивающих эти изменения в поверхностной экспрессии.

Хотя регуляторное влияние DAG / PE на NCC было продемонстрировано здесь в двух системах, вопрос о том, что запускает высвобождение DAG в клетках дистальных канальцев млекопитающих, остается без ответа.Хорошо известно, что некоторые гетеротримерные G-белки активируют фосфолипазу C, которая затем высвобождает DAG и инозитол (1,4,5) -трифосфат из клеточной мембраны (рис. 7). Однако идентичность гормонального или физиологического стимула, который активирует GPCR и регулирует NCC, еще предстоит идентифицировать. Есть некоторые свидетельства того, что альдостерон регулирует NCC (32, 33). Однако рецептор минералокортикоидов не является GPCR. Ангиотензин II представляет собой GPCR, и есть некоторые свидетельства того, что ангиотензин II увеличивает поверхностную экспрессию NCC (34).Однако изменения функции NCC под действием ангиотензина II не были продемонстрированы, а увеличение поверхностной экспрессии является эффектом, противоположным тому, который мы наблюдаем при активации RasGRP1. Есть множество других GPCR, присутствующих в DCT, и в настоящее время нет окончательных исследований, связывающих эти рецепторы с функцией NCC. Дальнейшие исследования необходимы, чтобы определить эти вышестоящие регуляторы этого важного котранспортера.

Мы создали надежную воспроизводимую систему для изучения регуляции функции NCC в клетках DCT млекопитающих и использовали эту систему для корреляции функции с поверхностной экспрессией.Эта система позволила нам изучить регуляцию NCC с помощью DAG / PE, обнаружив, что регулятор транспортных белков, RasGRP1, опосредует эффекты DAG / PE независимым от PKC образом. Эти данные предполагают, что нам, возможно, потребуется пересмотреть эффекты на транспортные белки, которые ранее приписывались PKC. Кроме того, мы показали, что PEs, действуя через RasGRP1, по-видимому, предпочтительно активируют изоформу H-Ras Ras в клетках mDCT, что приводит к активации ERK1 / 2 и подавлению функции NCC и поверхностной экспрессии (рис.7).

Материалы и методы

Оценка функции NCC в клетках mDCT.

клеток мДСТ, выращенных до 90% слияния в 12-луночных планшетах, инкубировали при 37 ° C в изотонической среде, не содержащей Cl ^- [130 мМ глюконат натрия, 2 мМ / кг глюконата, 1,0 мМ глюконат кальция, 1 мМ / мг глюконата, 5 мМ HEPES / Трис (pH 7,4), 1 мМ амилорид, 0,1 мМ буметанид) в течение 30 мин для увеличения движущей силы поглощения радиоактивных индикаторов. В течение этого периода времени клетки обрабатывали различными исследуемыми агентами или носителем (ДМСО).Затем среду заменили на среду, содержащую ²² Na ⁺ [140 мМ NaCl, 1 мМ CaCl, 1 мМ MgCl, 5 мМ HEPES / Tris (pH 7,4), 1 мМ амилорид, 0,1 мМ буметанид, 0,1 мМ бензамила, 1 мМ уабаина и 1 мкКи / мл ²² Na ⁺ Cl ^-] с 0,1 мМ метолазоном или без него и инкубировали в течение 20 мин. Затем поглощение индикатора останавливали промыванием ледяным PBS. Затем клетки лизировали 0,1% (масс. / Об.) SDS. Радиоактивность измеряли с помощью жидкостной сцинтилляции и определяли концентрации белка в лизатах [анализ белка с бицинхониновой кислотой (BCA); Пирс].Поглощения были нормализованы до нмоль / мг. Поглощение, чувствительное к тиазидам, определялось разницей в поглощении с тиазидом и без него.

Подготовка и оценка функции NCC ооцитов X. laevis подробно описаны в SI Материалы и методы .

Биотинилирование клеточной поверхности.

клеток mDCT инкубировали в среде, не содержащей Cl ^-, в течение 15 мин.Затем к среде добавляли 100 мкМ TPA, 4αPDD или DMSO (носитель) на 15 мин. Среду, не содержащую Cl ^-, удаляли и добавляли среду для поглощения (без ²² Na ⁺ ) на 30 мин. Клетки промывали PBS, и белки клеточной поверхности метили, собирали и выделяли с использованием набора для точечного выделения белков клеточной поверхности (Pierce). Концентрации белка определяли с использованием набора для анализа белка BCA. Для анализа SDS / PAGE загружали 80 мкг общего белка из клеточных лизатов вместе с 30 мкл биотинилированного белка из контрольной группы ДМСО и пропорциональным объемом из остальных групп биотинилированного белка.

Активированный анализ Ras.

клеток мДСТ, выросших до 80% слияния после трансфекции миРНК, инкубировали в течение 30 мин в среде, не содержащей Cl ^-. В течение этого периода времени клетки обрабатывали 100 нМ ТРА в течение 15 мин. Затем клетки лизировали и подвергали аффинной очистке для активированного Ras с использованием набора для активации EZ-Detect Ras Activation Kit (Pierce). Затем был проведен иммуноблоттинг с использованием антител к Ras и его основным изоформам.

Анализ фосфорилирования ERK1 / 2.

клеток мДСТ, выросших до 80% слияния после трансфекции миРНК, инкубировали в течение 30 мин в среде, не содержащей Cl ^-. В течение этого периода времени клетки обрабатывали 100 нМ ТРА в течение 15 мин. Затем клетки лизировали в 1 мл лизиса. Лизаты гомогенизировали обработкой ультразвуком на льду. Образцы были подвергнуты иммуноблоттингу на фосфорилированный ERK1 / 2 и общий ERK1 / 2.

Другие методы.

Предыдущие методы также использовали типичное использование клеточных культур, иммунопреципитации, иммуноблоттинга, трансфекции siRNA и RT-PCR.Для получения полной информации об этих методах см. SI Материалы и методы .

Благодарности

Благодарим Юджина Чанга за советы и обсуждения. Эта работа была поддержана грантами Национального института здравоохранения K08 DK070668 (для RSH), T32 DK007510–19 (для BK), DK38510 (для MWM), DK42086 (для BK, MWM и RSH) и DK64635 (для GG) и грантом Leducq Foundation (SCH и G.ГРАММ.).

Сноски

• ^§ Кому может быть адресована корреспонденция. Электронная почта: steven.hebert {at} yale.edu или rhoover {at} Medicine.bsd.uchicago.edu

• Вклад авторов: B.K., L.M.J., L.L.C., N.V., M.W.M., S.C.H., G.G. и R.S.H. спланированное исследование; B.K., L.M.J., L.L.C., N.V., M.W.M. и R.S.H. проведенное исследование; B.K., L.M.J., L.L.C., N.V., M.W.M., S.C.H., G.Г., Р.С.Х. проанализированные данные; и B.K., L.M.J., L.L.C., S.C.H. и R.S.H. написал газету.

• Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

• Эта статья содержит вспомогательную информацию на сайте www.pnas.org/cgi/content/full/0709506104/DC1.

• © 2007 Национальная академия наук США

Группы доступности баз данных Exchange Server 2016

Для Exchange Server 2016 строительным блоком высокой доступности является группа доступности базы данных (DAG).Группы обеспечения доступности баз данных для Exchange 2016 очень похожи на группы обеспечения доступности баз данных для Exchange 2013, однако есть некоторые новые функции и способы поведения, о которых следует знать, которые я продемонстрирую в этой серии статей. Я также расскажу:

Давайте начнем с обзора концепций группы доступности базы данных.

Концепции группы доступности базы данных Exchange Server 2016

Группы доступности баз данных могут содержать до 16 серверов почтовых ящиков Exchange 2016, на каждом из которых размещаются копии одной или нескольких баз данных, которые реплицируются с копиями баз данных на других членах той же группы доступности базы данных.

Когда группа DAG создается впервые, в ней нет участников. Для обеспечения высокой доступности группы DAG требуется минимум два члена. Группы обеспечения доступности баз данных с двумя участниками достаточно распространены в качестве простого развертывания HA для Exchange, например, на схеме ниже два сервера Exchange 2016 и файловый ресурс-свидетель образуют группу доступности базы данных.

Группы доступности базы данных и кворум

Exchange Server используют базовый отказоустойчивый кластер Windows. Вам не нужно создавать, настраивать или даже прикасаться к отказоустойчивому кластеру Windows с помощью инструментов управления кластером, за исключением конкретных сценариев обслуживания, которые четко задокументированы.Когда вы добавляете участников в группу обеспечения доступности баз данных, компоненты отказоустойчивой кластеризации устанавливаются и настраиваются автоматически.

Кворум - это процесс голосования, который кластер использует для определения того, должна ли группа DAG оставаться в сети или отключаться. Если DAG переходит в автономный режим, все базы данных в DAG отключаются и становятся недоступными для конечных пользователей, что вызывает сбой.

Существует две модели кворума:

• Большинство узлов - когда группа DAG имеет нечетное количество участников, файловый ресурс-свидетель не требуется для процесса голосования кворума, поскольку члены группы DAG могут сами определять «большинство».Например, если один член группы DAG выходит из строя, 2/3 члена группы DAG все еще находятся в сети (большинство), а группа DAG может оставаться в сети. Если два члена группы DAG выходят из строя, 1/3 членов группы DAG все еще находятся в сети, что может привести к потере кворума и отключению группы DAG.
• Большинство узлов и общих файловых ресурсов - когда группа DAG имеет четное количество участников, свидетель общего доступа к файлам включается в процесс голосования кворума, чтобы гарантировать определение «большинства». Например, в группе DAG, состоящей из двух участников, если один из участников выходит из строя, половина участников все еще находится в сети (а не большинство), но можно ожидать, что группа DAG сможет противостоять отказу одного узла.Свидетель общего доступа к файлам используется как решающий фактор, что означает, что 2/3 «голосов» по-прежнему доступны, и группа DAG может оставаться в сети. Точно так же с группой DAG из четырех участников, если два участника потерпели неудачу, с файловым ресурсом-свидетелем все еще остается 3/5 «голосов» в сети, поэтому группа DAG может оставаться в сети.

Все группы доступности базы данных настроены с файловым ресурсом-свидетелем, независимо от того, используется ли он для голосования или заметок. Модель кворума автоматически корректируется группой DAG по мере добавления или удаления участников.

Выше я писал, что в некоторых сценариях сбоя группа DAG может потерять кворум и перейти в автономный режим.В некоторых случаях группа обеспечения доступности баз данных может поддерживать отключение большинства узлов при последовательных сбоях. Это происходит благодаря функции кластеров Windows Server 2012, называемой динамическим кворумом.

Копии баз данных и непрерывная репликация

Каждый член группы обеспечения доступности баз данных Exchange 2016 размещает одну или несколько копий базы данных и участвует в процессе непрерывной репликации, чтобы эти копии базы данных обновлялись с учетом изменений. Версия сервера Exchange 2016 определяет, сколько копий базы данных может разместить член группы DAG.Сервер Standard Edition может разместить до 5 копий базы данных, а сервер Enterprise Edition может разместить до 100 копий базы данных.

Члены группы обеспечения доступности баз данных Exchange 2016 могут размещать как активные, так и пассивные копии базы данных, поскольку переключение / отработка отказа происходит на уровне базы данных, а не на уровне сервера. Таким образом, нет понятия «активный сервер» или «пассивный сервер».

Во время непрерывной репликации данные журнала транзакций, созданные в активной копии базы данных, доставляются по сети членам группы DAG, на которых размещены пассивные копии базы данных.Затем эти члены группы DAG воспроизводят данные журнала транзакций, чтобы обновить свою пассивную копию базы данных. Воспроизведение может происходить немедленно или его можно настроить как изолированную копию базы данных.

Добавочное развертывание

Специальная установка Exchange Server 2016 для участников группы DAG не предусмотрена. Сервер почтовых ящиков Exchange 2016 может быть добавлен в DAG или удален из DAG в любое время, не влияя на базы данных и другие службы, размещенные на этом сервере. Пошаговое развертывание позволяет организациям развернуть один сервер сегодня, а затем, при необходимости, масштабировать до DAG позже, без какого-либо воздействия на производственные службы.

Сети группы доступности баз данных

Сеть DAG - это одна или несколько IP-подсетей, к которым напрямую подключены члены DAG. Каждая группа доступности базы данных Exchange 2016 имеет по крайней мере одну сеть DAG, которая используется для клиентского трафика. Группа DAG также может иметь одну или несколько отдельных выделенных сетей для трафика репликации базы данных.

Учитывая скорость современных сетей, обычно рекомендуется использовать только одну сеть DAG, которая проще в управлении и создает более предсказуемый сценарий отказа.

Устойчивость сайта

Группа доступности базы данных Exchange 2016 обеспечивает высокую доступность для Exchange в пределах одного центра обработки данных или сайта Active Directory.