Бтк е: Недопустимое название — Википедия

Содержание

BTC e-Cruise — 🛵 Электрические скутеры 2021

Евгеника о природе (ГМО) 

Критический расспрос на тему евгеники о природе (ГМО) стал причиной нападения на основателя этого веб-сайта. Его бизнес, дом и личные вещи были уничтожены , ему пришлось вынести неестественную клевету , насилие и попытки запугать его, включая скрытую угрозу смерти, которая указывает на связь с ГМО.

Создатель этого сайта не имеет политических, религиозных или идеологических мотивов или интересов . Критический вопрос евгеники о природе (ГМО) является философским по своей природе, в общих интересах благополучия природы и процветания человечества.

Аргументы относительно евгеники о природе (ГМО):Евгеника Плагин WordPress Ban mystery:WordPress Художественная галерея заблокирована в Twitter:TwitterМоховые шары запрещены на YouTube:Моховые шары


Коллапс природы на Земле

Группа из 200 ведущих ученых указывает, что Земля находится на грани массового вымирания, которое в ближайшие десятилетия может привести к забвению миллион видов животных, что может вызвать коллапс Природы на Земле.

(2021) Глава ООН призывает к смелым действиям, чтобы положить конец «самоубийственной войне с природой»

“Мы проигрываем нашу самоубийственную войну против природы. Надвигается крах экосистемы. В течение десятилетий миллионы видов животных могут исчезнуть, что приведет к коллапсу Природы на Земле.”

Промышленные компании использовали океан как свалку токсичных отходов. Опасные промышленные химические вещества накапливаются в океане уже 150 лет.

В некоторых районах, которые больше, чем на суше, в воде содержится в 6 раз больше пластика по сравнению с планктоном. Некоторые из этих зон в океане называются «зоной смерти», где не может жить рыба.

В Бразилии пятая часть джунглей будет сожжена в ближайшие годы для целей промышленного развития. Ожидается, что тропические леса Амазонки исчезнут в течение десятилетий.

За последние десятилетия погибло 67 процентов всех морских птиц. Многие виды морских птиц могут исчезнуть в течение десятилетий.

За последние десятилетия погибло 75 процентов всех насекомых. Через десятилетия может наступить переломный момент, после которого коллапс природы станет неизбежным.

Вдобавок ко всему, евгеника от природы (ГМО) навязывается коррупцией.

WikiLeaks: США нацелены на противников ГМ-культур: «Ешьте ГМО! или мы причиним боль »

В телеграммах говорится, что американские дипломаты работают напрямую на такие компании GM, как Monsanto и Bayer.
Противники ГМО наказаны « возмездием и болью ».

Аргументы относительно евгеники о природе (ГМО):Евгеника


Сброс токсичных отходов в океаны

Ежегодно в Мировой океан сбрасывается 180 миллионов тонн токсичных, химических и радиоактивных отходов. Это называется темно-синим сбросом .

Промышленные компании рассматривают океан как бездонную яму с идеей «вне поля зрения, вне памяти».

Промышленные компании использовали океан как свалку ☣️ токсичных отходов. Опасные промышленные химикаты и ☢️ радиоактивные отходы накапливались в океанской воде в течение 150 лет, до такой степени, что мертвые детеныши китов выбрасываются на берег, полные смертоносных химикатов, и что 🇯🇵 Япония недавно отказалась от партии токсичного китового мяса из 🇳🇴 Норвегия.

Посмотреть отчет о сбросе токсичных отходов в Мировой океан:Океаны

BTK/E 87121266 MURRPLASTIK Кабельные сальники и держатели Втулка для кабельного ввода тип KDT/xE Заглушка

Втулка маленькая

KDT/ZE 0387121210Черный– 3 – 4Да / / Нет110
KDT/ZE 0487121212Черный– 4 – 5Да / / Нет110
KDT/ZE 0587121214Черный– 5 – 6Да / / Нет110
KDT/ZE 0687121216Черный– 6 – 7Да / / Нет110
KDT/ZE 0787121218Черный– 7 – 8Да / / Нет110
KDT/ZE 0887121220Черный– 8 – 9Да / / Нет110
KDT/ZE 0987121222Черный– 9 – 10Да / / Нет110
KDT/ZE 1087121224Черный– 10 – 11Да / / Нет110
KDT/ZE 1187121226Черный– 11 – 12Да / / Нет110
KDT/ZE 1287121228Черный– 12 – 13Да / / Нет110
KDT/ZE 1387121230Черный– 13 – 14Да / / Нет110
KDT/ZE 1487121232Черный– 14 – 15Да / / Нет110
KDT/ZE 1587121234Черный– 15 – 16Да / / Нет110

Втулка большая

KDT/ZE 1687121236Черный– 16 – 17Нет / / Да110
KDT/ZE 1787121238Черный– 17 – 18Нет / / Да110
KDT/ZE 1887121240Черный– 18 – 19Нет / / Да110
KDT/ZE 1987121242Черный– 19 – 20Нет / / Да110
KDT/ZE 2087121244Черный– 20 – 21Нет / / Да110
KDT/ZE 2187121246Черный– 21 – 22Нет / / Да110
KDT/ZE 2287121248Черный– 22 – 23Нет / / Да110
KDT/ZE 2387121250Черный– 23 – 24Нет / / Да110
KDT/ZE 2487121252Черный– 24 – 25Нет / / Да110
KDT/ZE 2587121254Черный– 25 – 26Нет / / Да110
KDT/ZE 2687121256Черный– 26 – 27Нет / / Да110
KDT/ZE 2787121258Черный– 27 – 28Нет / / Да110
KDT/ZE 2887121260Черный– 28 – 29Нет / / Да110
KDT/ZE 2987121262Черный– 29 – 30Нет / / Да110
KDT/ZE 3087121264Черный– 30 – 31Нет / / Да110

Регулируемые втулки для проводов (степень защиты IP42)

KDT/VE 3-787121272Черный– 3 – 7Да / / Нет110
KDT/VE 7-1087121274Черный– 7 – 10Да / / Нет110

Сложная втулка, 2-кратная

Двойная втулка KDT/ZE 2×487121284Черный– 4 –Да / / Нет210
Двойная втулка KDT/ZE 2×587121286Черный– 5 –Да / / Нет210
Двойная втулка KDT/ZE 2×687121288Черный– 6 –Да / / Нет210
Двойная втулка KDT/ZE 2xASI87121280ЧерныйДа / / Нет210
Двойная втулка KDT/ZE 2×887121291Черный– 8 –Да / / Нет210

Сложная втулка, 4-кратная

Двойная втулка KDT/ZE 2×787121290Черный– 7 –Да / / Нет210
Сложная втулка KDT/ZE 4×287121292Черный– 2 –Да / / Нет410
Сложная втулка KDT/ZE 4×387121293Черный– 3 –Да / / Нет410
Сложная втулка KDT/ZE 4×487121294Черный– 4 –Да / / Нет410
Сложная втулка KDT/ZE 4×587121295Черный– 5 –Да / / Нет410
Сложная втулка KDT/ZE 4×687121296Черный– 6 –Да / / Нет410

Втулка ASI (для кабеля ASI)

KDT/ZE ASI87121282ЧерныйДа / / Нет110

Заглушки для втулки ASI

BST KDT/ZE ASI87121281Черный10

Адаптер втулочный (адаптер для маленькой втулки)

ATG/E87121268ЧерныйНет / / Да110

Шланговый наконечник

SDT/ZE 0787174250ЧерныйДа / / Нет110M10/P07
SDT/ZE 0987174252ЧерныйДа / / Нет110M12/P09
SDT/ZE 1187174254ЧерныйДа / / Нет110M16/P11
SDT/ZE 1687174256ЧерныйНет / / Да110M20/P16
SDT/ZE 2187174258ЧерныйНет / / Да110M25/P21

Заглушка

BTK/E87121266ЧерныйДа / / Нет010
BTG/E87121270ЧерныйНет / / Да010

Биржа BTC-e частично вернула доступ к средствам, есть план дальнейшей работы

10 Августа, 2017, 13:00

2965

Представители биржи BTC-e опубликовали план по погашению долгов перед клиентами. Об этом сообщает Forklog. В сообщении говорится, что руководители биржи получили контроль над 55% средств. Остальные 45% остаются под арестом, большая часть из них в фиате. Администрация сервиса заявила, что не сможет продолжать работу под существующим брендом BTC-e. 

Руководители биржи отметили, что сейчас ведут переговоры с некой инвестиционной компанией о покупке и скорейшем запуске сервиса, а также погашении долгов перед клиентами. В случае успешных переговоров, все балансы будут переданы этой компании, после чего будет произведен их пересчет. «По факту перерасчетов у всех пользователей появится возможность вывести 55% своих средств из системы», — говорится в сообщении.

«Все обязательства по фиату (USD, EUR, RUR) будут переведены в токены BTE (1 BTE равен $1) по курсу на дату конвертации. Возможно, для более оперативного закрытия долговых обязательств, по токенам BTE будет проведено ICO. Если у вас на балансе сумма в коинах, то у вас будет списано 45% баланса коинов и зачислено 45% BTE. По курсу на день конвертации. Если у вас баланс в BTE, то вам будет зачислено 45% в коинах (сумма будет разбита на 7 разных коинов поровну BTC, LTC, NMC, NVC, PPC, ETH, DSH) и списана сумма в размере 45% в BTE», — добавили представители сервиса. 

Представители BTC-e подчеркнули, что инвестиционная компания работает с соблюдением KYC («знай своего клиента» — прим. ред.), AML (практика противодействия отмыванию денежных средств — прим. ред.) и необходимых для этой деятельности лицензий, в связи с чем всем пользователям необходимо будет пройти верификацию. ​Ориентировочно запуск новой биржи произойдет в «конце августа».

Биржа BTC-e ушла в офлайн 25 июля. Это случилось после того, как был задержан Александр Винник, которого власти США обвиняют в отмывании около $4 млрд с помощью якобы принадлежащей ему биржи. Представители BTC-e отрицают связь с Винником. 

BTC-e коды: инструкция по применению

Рынок криптовалют напоминает родео — лишь немногие из «всадников» смогли удержать свои позиции.

Но есть такие, которые прочно укрепились как наиболее популярные. Среди них — BTC-e код.

Как и в спорте, у каждого победителя есть особенности, отличающие его от конкурентов. Здесь ими служат безопасность, высокая скорость транзакций, возможность использования кодов для передачи денег, малая подверженность волатильности, и минимальные комиссии.

Немного истории

Начала свое существование биржа в 2011 году, а коды были придуманы для того, чтобы максимально упростить обменные операции на бирже.

Регистрация биржи рассредоточена, и ее правовая юрисдикция, как следствие, не подчинена одной стране. Торговая площадка также использует сторонние банковские услуги, не указывая в официальных публикациях на сайте никаких реквизитов.

Такое положение дел не является чем-то странным для российского рынка, а вот западных инвесторов это держит настороже, что не дает бирже развиваться в полной мере.

Штат сотрудников BTC-е небольшой, что вызывает задержки с техподдержкой. Несмотря на то, что создатели биржи обещают расширение команды, что могло бы ускорить транзакции, пока что лучше использовать сторонний обменник BTC-e. Услугами подобных обменных сервисов пользуются те, кто хочет провести транзакцию выгоднее и оперативнее.

Способы покупки

Направления обмена довольно разнообразны, купить BTC-e код можно с помощью Perfect Money, банковского трансфера, с помощью Okpay, Fasapay, ecoin и многих других платежных систем. Процент, взимаемый за операции по этим направлениям, обычно не превышает 1. Ликвидность BTC-E кодов ничуть не ниже, чем у самого Биткоина или же фиатных валют. Это подтверждено тем фактом, что многие сервисы при обмене у них кодов на фиат могут даже доплачивать небольшой % сверху.

Коды хранить лучше в надежном месте, к которому имеете доступ только вы. При необходимости лучше передавать код по частям, для того чтобы избежать их попадания в руки третьих лиц.

Как с помощью знаний получить btc-e код?

На крупнейшем форуме о Биткоин и криптовалютах есть тема-викторина, связанная с кодами. Суть игры состоит в том, что один из участников форума генерирует код на небольшую сумму денег, и выкладывает его без какой-то значимой части. Остальные участники форума пытаются отгадать код с помощью наводящих вопросов, придуманных автором. Диапазон вопросов разнообразен от простых— например, вопрос о буквенном обозначении лудольфого числа, в народе всего лишь обозначающей число пи или же замена букв BMW в вопросе о немецкой автомарке. Есть и такие, ради разгадки которых придется подумать и привлечь посторонние источники вроде википедии.

Первый человек, угадавший комбинацию, имеет полное право на его обналичивание.

ВНИМАНИЕ!

15 декабря на «Клерке» стартует обучение на онлайн-курсе повышения квалификации для получения удостоверения, которое попадет в госреестр. Тема курса: управленческий учет.

  • Длительность 120 часов за 1 месяц
  • Ваше удостоверение в реестре Рособрнадзора (ФИС ФРДО)
  • Выдаем Удостоверение о повышении квалификации
  • Курс соответствует профстандарту «Бухгалтер»

Повышайте свою ценность как специалиста прямо на «Клерке». Подробнее

E | Finance Magnates RU

Греческие власти исполняют прошлогоднее постановление суда, они поддержали запрос Франции на экстрадицию Александра Винника, предполагаемого российского хакера, обвиняемого в отмывании преступных доходов на сумму 4 млрд долларов через криптобиржу BTC-e.… Читать дальше Прокуратура Соединенных Штатов требует от уже несуществующей криптовалютой биржи BTC-e и ее предполагаемого владельца, Александра Винника, уплаты штрафов в размере свыше 100 млн долларов. Согласно судебным документам, поданным в Северном… Читать дальше Сергей Майзус, предприниматель, хорошо известный участникам внебиржевой и сопутствующих индустрий, не смог защитить свою честь и достоинство в московском суде. На прошлой неделе новостное агентство RT сообщило о том, что… Читать дальше Дочь Дмитрия Хавченко, бывшего бойца в рядах самопровозглашенной Донецкой народной республики (ДНР), стала владельцем сингапурской компании World Exchange Services, официального оператора криптовалютной биржи Wex, которая является правопреемником скандально известного аналогичного… Читать дальше Греческий суд в Салониках удовлетворил второй запрос генеральной прокуратуры РФ о выдаче Александра Винника, бывшего руководителя криптобиржи BTC-e. И это лишь 2 недели после того, как был удовлетворен запрос на экстрадицию… Читать дальше Спустя год после задержания, россиянин Александр Винник, бывший руководитель криптобиржи BTC-e, будет выдан Франции. Такое решение принял сегодня суд в Греции. Адвокаты Винника намерены подают апелляцию, об этом сообщило сегодня… Читать дальше Скандальная криптобиржа BTC-e возобновила свою работу, но уже на другом домене, ну а брокер бинарных опционов IQ Option теперь тоже готовится к первичному размещению собственных токенов (ICO). Об этом и… Читать дальше Злополучная криптобиржа BTC-e, ушедшая в офлайн со скандалом более месяца тому назад, возобновила сегодня свою работу, но уже на другом, старом домене btc-e.nz. Тем не менее, речь идет лишь о… Читать дальше Вслед за представителями BTC-e, которые поделились накануне своими планами вернуть средства пользователям скандальной криптобиржи, сегодня прокомментировали текущую ситуацию и в компании Mayzus Financial Services. Представители платежного сервиса, сообщили о том,… Читать дальше Официальные представители ушедшей в офлайн криптобиржи BTC-e опубликовали накануне некий чрезвычайный план выхода из сложившейся ситуации со скандальным закрытием одной из крупнейших площадок для торговли биткоинами и с арестованными фиатными… Читать дальше

Москва | Криптовалютная биржа BTC-E пообещала восстановить работу через 5-10 дней

Ещё новости о событии:

Bloomberg: россиянин, отмывший с помощью биржи биткоинов $ 4 млрд, пойман в Греции

Россиянин, разыскиваемый Соединенными Штатами, по подозрению в организации операций по отмыванию более 4 миллиардов долларов при помощи биткоинов, задержан в Греции.

11:23 27.07.2017 Business-Vector.Info — Саратов

В США россиянину предъявили обвинение в отмывании денег и махинациях с криптовалютой

Министерство юстиции США сообщило о предъявлении обвинения в отмывании денег россиянину Александру Виннику, передаёт Reuters.
11:54 27.07.2017 Между Строк — Нижний Тагил

В США россиянина обвиняют в махинациях с криптовалютой

Мужчине грозит срок до 20 лет лишения свободы. (Казань, 27 июля, «Татар-информ»).
08:21 27.07.2017 ИА Татар-информ — Казань

Россиянина обвинили в отмывании $4 млрд с помощью биткоинов

Россиянину Александру Виннику, задержанному в среду в Греции по подозрению в махинациях с криптовалютой, предъявили  обвинение в США.
07:52 27.07.2017 Петербургский дневник — Санкт-Петербург

Задержанному в Греции россиянину США предъявлены обвинения в отмывании миллиардов

США официально предъявили обвинения россиянину, которого накануне задержали в Греции, сообщает «Россия 24» .
07:40 27.07.2017 Вести.Ru — Москва

Греция: задержан россиянин, попавшийся на миллиардной афере

При помощи криптовалюты было легализировано около 4 млрд долларов Полиция Греции задержала в Салониках россиянина, по подозрению в отмывании денег через криптовалюту Bitcoin.
18:55 26.07.2017 ИА Чеченинфо — Грозный

В Греции по подозрению в «отмывании» $4 млрд задержан россиянин

Полиция Греции задержала гражданина России по подозрению в «отмывании» $4 млрд.
17:01 26.07.2017 Петербургский дневник — Санкт-Петербург

Полиция Греции по запросу властей США задержала подозреваемого в кибермошенничестве россиянина

Полиция Греции задержала россиянина по запросу властей США. Он был задержан в номере отеля на севере Греции, сообщает ТАСС .
17:01 26.07.2017 Бизнес Online — Казань

В Греции по подозрению в отмывании $ 4 млрд через биткоин-транзакции задержан россиянин

Посольство России в Греции подтвердило информацию о задержании гражданина России, который находится в розыске в США по подозрению в отмывании $ 4 млрд через биткоин-транзакции.
16:58 26.07.2017 Фонтанка — Санкт-Петербург

В Греции задержан россиянин, «отмывший» четыре миллиарда долларов через биткоины

В Салониках (Греция) задержан 38-летний россиянин, который шесть лет руководит преступной группировкой по отмыванию денег.
20:24 26.07.2017 A42.Ru — Кемерово

Россиянина задержали в Греции по подозрению в отмывании 4 млрд долларов

Гражданин России задержан по запросу США, которые подозревают его в кибермошенничестве.
16:00 26.07.2017 ИА Татар-информ — Казань

В Греции задержали россиянина по подозрению в отмывании четырех миллиардов долларов

В Греции местная полиция вместе с американскими коллегами задержали гражданина России.
15:23 26.07.2017 Lenizdat.ru — Санкт-Петербург

В Греции задержали россиянина за отмывание $4 млрд через биткоины

Россиянина задержали по запросу США В греческом городе Салоники задержан 38-летний россиянин, который шесть лет руководил преступной группировкой, отмывавшая деньги.
14:54 26.07.2017 Gorod48.ru — Липецк

Арестован владелец крупнейшей биржи биткоинов BTC-e, платформу подозревают в отмывании $4 миллиардов

США попросили греческих коллег арестовать владельца крупнейшей платформы по торговле битконами в связи с обвинением в отмывании денег. Биржа закрыта, предъявлен штраф на 110 миллионов долларов. Самому владельцу выписан штраф на 12 миллионов.

25 июля в Греции арестовали Александра Винника, гражданина РФ, который создал и управлял крупнейшей биткоин биржей BTC-e. Сразу же после этого биржа заявила о том, что ушла на технические работы на несколько часов, которые продолжаются до сих пор. С 26 июля обновлений в twitter портала не было.

По мнению аналитиков все деньги, которые в данный момент были внутри системы, уже или в ближайшее время будут украдены.

Охота за преступниками

Винник отдыхал в Греции, когда его арестовали сотрудники греческой полиции. Однако за ним уже давно наблюдали, как греки, так и американское ФБР. По версии американских правоохранительных органов, Винник с партнёрами создал в 2011 году платформу и через неё отмыл порядка 4 миллиардов долларов.

Общий список нарушений Винника и его компании насчитывает 21 пункт. До последнего времени постановления суда о выдаче ордера было засекречено, хотя сам он был выдан 17 января 2017 года.

Проблема платформы не в том, что она занималась криптовалютами, а в том, что действовала на территории США незаконно, отмывала деньги и помогала обходить закон другим лицам.

По имеющимся данным, администрация сайта в личном общении через чат давала конкретные советы, как проводить незаконные денежные операции, как отмывать доходы и выводить прибыль от незаконной деятельности при торговле наркотиками, оружием и т.п.

При этом платформа сохраняла высокую степень анонимности своих клиентов, требуя предоставить лишь е-мейл адрес, пароль и имя пользователя. Это в отличие от других популярных и расположенных в тех же США платформ, которые просят пройти полную идентификацию и прислать копию паспорта.

Биткоин не признаем, но налоги заплатите: Колумбия хочет обложить криптовалюты налогом, не признавая их

По версии следователей BTC-e отмывала и прятала нелегальные средства, в том числе украденные на других платформах или полученные от вымогательства программами наподобие «Cryptolocker» и «Locky». Даже к Liberty Reserve, которую США закрыли в 2013 году, платформа имела отношение – она была клиентом LR, а затем переняла часть активов.

Возможно ситуация не стала бы столь явной и не дошла бы до арестов в гостиницах, если компания заранее начала выходить из тени и отмывать свою репутацию, а не деньги. Как оказалось, у компании не было реального юридического лица, владельцы оставались в тени, плюс не было лицензии для проведения финансовой деятельности. При том, что сервера стояли в США и работали с американскими гражданами.

Таким образом система нарушала базовые принципы Anti Money Laundering (AML) законодательства и это не вспоминая о непосредственно самом отмывании.

Bitcoin должен стать легальным в России: мир признает биткоин легальным платёжным средством

К чему приведёт расправа?

Представители финансовой спецслужбы США FinCEN, которая активно подключилась к расследованию, не скрывают, что происходящее сегодня послужит уроком другим и сдержит наглое использование криптовалют при отмывании преступных доходов.

По крайней мере в таких масштабах.

Пока что понятно, что компания получила штраф на 110 миллионов, а Александр Винник – 12 миллионов. При этом он находится на территории Греции и ждёт экстрадиции в США, которая в организуется в данный момент.

Скорее всего в США ему грозят дополнительные штрафы и тюремное заключение от 5 до 20 лет по разным нарушениям. Если сложить все сроки вместе, то выйдет до 55 лет.

При этом остаётся вопрос: вернут ли деньги тем вкладчикам, которых привлёк масштаб и продолжительная история платформы и которые оставались законопослушными гражданами?

Есть подозрение, что денег они лишились. Скорее всего сейчас их средства перекачиваются в другие платформы и кошельки, если конечно ФБР и FinCEN физически не отключили сервера BTC-e от Интернета.

К сожалению, главное преимущество криптовалют – скорость и анонимность – в таких ситуациях играет против владельцев цифровых активов. Это риск, который накладывается в связи с минимальным регулированием цифровых валют и высокой степенью независимости от государств и Центральных банков.

С другой стороны, где выше риск, там и выше потенциальные заработки. Если бы биткоин не оставался бы рискованным капиталовложением, то вряд ли бы он продолжал стремительный рост. Аналитики банков, бизнес-изданий и даже государственные деятели предсказывают рост биткоина до 5-10 тысяч долларов с примерно 3 тысяч сегодня.

Оформляем в Антигуа и Барбуде гражданство за инвестиции в 2017 году, расплачиваясь биткоинами и пользуясь другими преимуществами

Биткоин в законе

Несмотря на то, что крупная биржа рухнула и вызвала ажиотаж в правоохранительных органах размахом своей нелегальной деятельности, биткоин всё ещё остаётся игроком на поле финансовых и инвестиционных продуктов. Его статус до конца не определён в мире (кроме, как в Японии, которая признала криптовалюты легальным средством платежа, но не валютой). Это не мешает изучать его, инвестировать в него и даже использовать для развития бизнеса.

Всё больше сфер бизнеса, даже оффлайн, используют биткоин для привлечения внимания и увеличения доходности. Если хотите прокатиться на такси за биткоины, то приезжайте в Таллинн – там предприимчивый таксист, который узнал о существовании биткоина по телевизору, увеличил свой доход втрое после введения платежей в криптовалюте.

В России с биткоинами пока двояко: часть властей говорит о возможной легализации. Другая, как судебные власти в Петербурге, блокируют сайты с информацией о криптовалюте и крипто-обменники пачками по сорок штук.

Как передать биткоин по наследству: опасности, возможности, планирование

Использовать биткоины можно и нужно, но осторожно. Если же вы используете биткоин как инвестиционный продукт, то выбирайте платформы, где выполняются правили AML и KYC. Иначе США закроют и конфискуют ваши деньги «за отмывание».

Если же биткоины вам непонятны, то открывайте иностранный банковский счет: это не так прибыльно, как рискованные инвестиции, но стабильно, удобно и безопасно. Записывайтесь на бесплатную консультацию прямо сейчас!

Метки: Биткоин Использование Криптовалют США

BTK / E 87121266 MURRPLASTIK Системы кабельных вводов и держатели Втулка для кабельного ввода, тип KDT / xE Заглушка для заглушки

Черный — 3 — 4 90 012 Черный 900D 16000 90 012-27-28 ZE 301295 Счетверенная втулка Черный

Втулка, малая

KDT / ZE 9129 да / / нет 1 10
KDT / ZE 04 87121212 Черный — 4-5 да / / нет 1 10
KDT / ZE 05 87121214 Черный — 5 — 6 да / / нет 1 10
KDT 06 87121216 Черный — 6-7 да / / нет 1 10
KDT / ZE 0 7 87121218 Черный — 7 — 8 да / / нет 1 10
KDT / ZE 08 87121220 Черный9 — 8 — 9 да / нет 1 10
KDT / ZE 09 87121222 Черный-9 — 10 да / нет 1 10
KDT / ZE 10 87121224 Черный — 10-11 да / нет 1 10
KDT / ZE12 11 Черный-11-12 да / нет 1 10
KDT / ZE 12 87121228-12-13 да / / нет 1 10
KDT / ZE 13 87121230 Черный-13-14 да / нет 1 10
KDT / ZE 14 87121232 Черный — 14-15 да / нет 1 10
KDT / ZE 15 87121234 Черный — 15 — 16 да / / нет 1 10

Втулка, большая

87121236 Черный — 16-17 нет / / да 1 10
KDT / ZE 17 87121238 Черный-17 — 18 нет / / да 1 10
KDT / ZE 18 87121240 Черный — 19 нет / / да 1 10
KDT / ZE 19 87121242 Черный — 19-20 нет / / да 1 10
KDT / ZE 20 87121244 Черный — 20 — 21 нет / / да 1 10
KDT / ZE 21 Черный — 21 — 22 нет / / да 1 10
KDT / ZE 22 87121248 Черный-22-23 нет / / да 1 10
KDT / ZE 23 87121250 Черный-23-24 нет / да 1 10
KDT / ZE 24 87121252 Черный-24 — 25 нет / / да 1 10
KDT / ZE 25 87121254 Черный — 25 — 26 нет / / да 1 10
KDT / ZE 26 87121256 — Черный 87121256 — Черный 26 — 27 нет / / да 1 10
KDT / ZE 27 87121258 Черный нет / / да 1 10
KDT / ZE 28 87121260 Черный-28-29 нет / / да 1 10
KDT / ZE 29 87121262 Черный — 29 — 30 нет / / да 1 10
87121264 Черный — 30 — 31 нет / / да 1 10

Изменяемая втулка кабеля (класс защиты IP 42)

KDT / VE 3-7 87121272 Черный — 3-7 да / / нет 1 10
KDT / VE 7-10 87121274 Черный-7-10 да / / нет 1 10

Многолинейная втулка 2 линии

KDT / ZE 2×4 с двойной втулкой 87121284 Черный — 4 — да / нет 2 10
KDT / ZE 2×5000 87128 2×5 двойная втулка Черный — 5 — да / / нет 2 10
KDT / ZE 2×6 двойная втулка 87121288 Черный — 6 — да нет 2 10
KDT / ZE 2xASI с двойной втулкой 87121280 Черный да / / нет 2 10
KDT / ZE 2×8 двойная втулка 87121291 Черный-8 — да / нет 2 10

Многолинейная втулка, 4 линии

KDT / ZE 2×7, двойная втулка 87121290 Черный — 7 — да / нет 2 2 2
KDT / ZE 4×2 с четырьмя втулками 87121292 Черный-2 — да / нет 4 10
4×2 KDT / 4 Gruple 87121293 Черный-3 — да / / нет 4 10
9000 9 KDT / ZE 4×4 Счетверенная втулка 87121294 Черный — 4 — да / нет 4 10
KDT / ZE 4×50009 — 5 — да / / нет 4 10
KDT / ZE 4×6 четырехступенчатая втулка 87121296 Черный — 6 —9 да / нет 4 10

Втулка ASI (для кабеля ASI)

KDT / ZE ASI 87121282 Черный
0
да / нет 1 10

Заглушка для втулки ASI

BST KDT / ZE ASI 9000 9 87121281 Черный 10

Переходник для втулки (переходник для маленькой втулки)

ATG / E 87121268
0 / да

2

E
87121268 1 10

Шланговая втулка

SDT / ZE 07 87174250 Черный да / 1 M10 / P07
SDT / ZE 09 87174252 Черный да / нет 1 10 M12 / P09
SDT 87174254 Черный да / / нет 1 10 M16 / P11
SDT / ZE 16 87174256 Черный нет / / да 1 10 M20 / P16

2

SDT9 / ZE 87174258 Черный нет / / да 1 10 M25 / P21

Заглушка для манекена

0

0 Черный

да / нет 0 10
BTG / E 87121270 Черный нет / да 0 10

Внутри Mind of Btk Lib / E: Правдивая история тридцатилетней охоты на печально известного серийного убийцу из Уичито (компакт-диск)

Этот драматический и захватывающий психологический триллер, посвященный истинному преступлению, представляет собой глубокое закулисное повествование одной из самых странных и ужасных историй о серийных убийцах в истории США.В течение 31 года мужчина, называвший себя BTK (Привязать, Пытать, Убить) терроризировал город Уичито, штат Канзас, душил и изнасиловал несколько женщин (и одного ребенка), насмехаясь над полицией и обществом частыми письмами, сообщениями и т. Д. Фотографии с места преступления, украденное у его жертв имущество, хвастовство своими преступлениями в переписке с местными газетами, на телевидении и на радиостанциях, описание себя как психотического и сексуального извращенца, который утверждал, что я не могу это остановить. После того, как он, казалось, исчез в течение девяти лет, он внезапно появился снова, жалуясь, что никто не уделяет ему достаточно внимания, что он совершил преступления, за которые ему не доверяли.Когда в конечном итоге БТК был схвачен с использованием многих приемов, предложенных самим Дугласом, БТК оказался шокирующим, что это был 61-летний женатый мужчина, лидер скаутов, президент его церкви, с двумя детьми, который работал офицером по соблюдению Кодекса в правительстве города Уичито. , приставания к гражданам из-за их лужаек и уборки мусора, прославленный ловец собак … бюрократический хулиган. Джон Дуглас впервые был привлечен к делу в качестве специалиста по профайлингу в 1980 году и с тех пор принимал активное участие в этом деле и всех его основных участниках.После ареста Рейдера он смог получить единственное эксклюзивное интервью с момента вынесения приговора, а также эксклюзивные интервью с семьей, друзьями и полицией. В результате он может раскрыть сенсационную новую информацию о том, почему Рейдер сделал то, что он сделал, и почему он останавливался на долгое время, прежде чем снова всплыть на поверхность. Дуглас рассказывает всю невероятную историю, а также извлекает из нее программу новой и улучшенной полицейской методологии, чтобы помешать таким серийным убийцам оставаться на свободе, включая раннее вмешательство в развитие детей и более активное участие общественности в задержании.

Кто такой Деннис Линн Рейдер, убийца БТК из Уичито, штат Канзас?

Деннис Рейдер — серийный убийца, терроризировавший жителей Уичито на протяжении десятилетий, с 1974 по 1991 год. Он дал себе прозвище БТК, которое, по его словам, он и будет делать: связывать, пытать и убивать своих жертв.

Деннис Рейдер был арестован 26 февраля 2005 года в Парк-Сити, штат Канзас, и привлечен к уголовной ответственности по 10 пунктам обвинения в убийстве первой степени за убийства Джозефа Отеро, Джули Отеро, Джозефин Отеро, Джозефа Отеро-младшего., Кэтрин Брайт, Ширли Виан Релфорд, Нэнси Фокс, Вики Вегерле, Марин Хедж и Долорес Дэвис.

Рейдер работал в Парк-Сити инспектором по соблюдению нормативных требований, отвечая за контроль над животными и соблюдение общих норм. Был женат, имел двоих взрослых детей; лидер своей церкви, лютеранской церкви Христа; бывший лидер бойскаутов; ветеран ВВС; и выпускник Вичитского государственного университета в 1979 году.

Рейдер перешел на работу в город через три года после того, как оставил работу в офисе компании национальной безопасности в Уичито.Представители ADT Security, базирующейся в Бока-Ратон, Флорида, заявили, что Рейдер работал в офисе в Уичито с ноября 1974 года по июль 1988 года.

Те, кто знал Рейдера, сказали, что он уделял внимание деталям и ценил аккуратность. В своей церкви он раздавал церковные бюллетени и приветствовал новых членов. О нем так хорошо думали, что он стал президентом церковного собрания.

Другие называли его помешанным на контроле. Как инспектор по соблюдению нормативных требований в Парк-Сити, он угрожал и шпионил за людьми.Его описывали как жестокого и высокомерного во время поездки за власть.

Связь с БТК

БТК разослала несколько писем с насмешками в полицию, СМИ и жертв преступлений в 1970-х годах, когда он взял на себя ответственность за семь убийств и предложил называть его БТК, чтобы «связать их, замучить, убить». Письма прекратились в 1979 году.

В некоторых письмах и посылках, которые он отправлял в полицию и СМИ, содержалась информация об убийствах, которая так и не была предана огласке. Некоторые из них включали фотографии его жертв, как они жили, так и умерли, а также сувениры, которые он взял с мест преступлений.

БТК описывал сексуальные ощущения, которые он испытывал от пыток. Он написал, что довел несколько жертв до смерти. Затем он дал им немного воздуха. Потом он снова их задушил.

Убийство Рейдера, возможно, было письмом, которое он отправил в газету Wichita Eagle в марте 2004 года. Письмо пришло через 25 лет после последнего сообщения БТК и через два месяца после того, как The Eagle опубликовал рассказ о 30-й годовщине первых убийств — убийства четырех членов семьи Отеро.

Письмо, отправленное из БТК в Уичито Игл, получено в пятницу, 19 марта 2004 г. и направлено в Управление полиции Уичито. Фотография из архива

История, которая вернула БТК

В 30-ю годовщину первых убийств БТК репортер Wichita Eagle Херст Лавиана написал статью, которая была опубликована в газете 1 января.17, 2004. Вот отрывок из этой истории:

«Я не думаю, что люди сегодня осознают, какое напряжение было в Уичито в то время», — сказал юрист Роберт Битти, который учился в Западной средней школе в время. . . .

Хотя убийства прочно укоренились в умах тех, кто пережил их, Битти сказал, что многие уичитанцы, вероятно, никогда не слышали о BTK.

Он сказал, что использовал футляр BTK во время сегмента своего курса в прошлом году, и был удивлен такой реакцией.

«Студенты меня не узнали», — сказал он. «Никто из них не слышал об этом».

Рейдер счел эту историю возмутительной и игнорировать ее невозможно.

Разве они его не вспомнили? Разве они больше не чувствовали страха?

Он им покажет.

В своем письме в газету The Eagle от марта 2004 г. БТК признал заслугу убийства Вики Вегерле, нераскрытого нераскрытого дела 1986 г., которое никогда публично не приписывалось БТК.

В окружении репортеров и полицейских, лейтенант отдела убийств Уичито.Кен Ландвер зачитывает заявление во время пресс-конференции, в котором описывается информация, содержащаяся в недавних письмах серийного убийцы БТК о людях и событиях в его прошлом. (30 ноября 2004 г.) Фотография из архива Wichita Eagle

Расследование полиции и арест Денниса Рейдера

В ходе расследования и в ходе интервью с Рейдером после его ареста полиция получила ответы на большие и малые вопросы, которые озадачили следователей БТК и сыщиков-любителей БТК .

Его сообщения всегда содержали орфографические ошибки, опечатки. Люди задавались вопросом: было ли это намеренно или он пытался заставить людей думать, что он неряшлив или необразован? Разве английский не был его родным языком?

«Дело в том, что мистер Рейдер очень плохо пишет. Он не умеет писать, — сказал лейтенант полиции Уичито Кен Ландвер.

ДНК сыграла ключевую роль в окончательном аресте.

В 2000 году, за четыре года до того, как БТК прекратил молчание, холодное дело стало горячим.Детективы полиции Уичито Келли Отис и Дана Гоуг были назначены для работы над нераскрытым убийством в 1986 году 28-летней Вики Вегерле, жены и матери, которых нашли связанными и задушенными в своем доме на западе 13-го.

Полиция обнаружила у нее под ногтями ДНК мужчины. В 2003 году профиль был внесен в недавно созданную национальную базу данных преступников.

Но совпадения не было.

Однако тесты ДНК показали, что тот же убийца был в домах, где БТК задушил четырех членов семьи Отеро в 1974 году и Нэнси Фокс в 1977 году.

Однако после убийства Вегерле писем БТК не было. Никаких насмешек. Никаких угроз. Нет связи.

До марта 2004 года, когда снова появилась БТК с письмом в адрес The Eagle: ксерокопия трех фотографий Вегерле, сделанных убийцей, лежащих на полу, плюс копия ее пропавших без вести водительских прав.

На фотокопии также была подпись, которую убийца использовал в своих сообщениях на протяжении многих лет: странная конфигурация букв «B», «T» и «K», иногда с буквой «B», нарисованной, чтобы напоминать грудь.

Как только полиция увидела фотокопию, началась охота.

ДНК и дочь БТК

Следователи без ведома Керри Роусон, дочери Рейдера, воспользовались повесткой для получения образца ДНК из ее медицинских записей.

Ее ДНК сообщила им, что ее отец был БТК.

Человек ФБР постучал в дверь Роусона 25 февраля.

Она выглянула из своей крошечной квартирки недалеко от Детройта. У него был значок ФБР.

Она почти не ответила.Ее отец, офицер по соблюдению правил в пригороде Уичито, Парк-Сити, научил ее опасаться незнакомцев, а этот просидел в своей машине рядом с ее мусорным баком в течение часа. Она позвонила своему мужу.

Но после того, как парень из ФБР постучал, она впустила его на свою кухню, где она испекла шоколадный торт. Отныне запах шоколадного торта вызовет у нее тошноту.

Спросил, знает ли она, кто такой БТК.

Да. БТК — Привязка. Пытка. Убийство. — был серийным убийцей, который несколько десятилетий назад напугал ее маму.Парень из ФБР был ровесником ее отца — около пятидесяти, в очках и галстуке, нервничал. Она была замещающей учительницей, взявшей выходной, все еще в мятно-зеленой пижаме, хотя было уже далеко за полдень.

Ее отец был арестован по подозрению в БТК, сказал мужчина.

Ему нужно было сдать ее щеку на ДНК.

Деннис Рейдер сидит в зале суда округа Седжвик во время первого дня дачи показаний на этапе вынесения приговора 17 августа 2005 года.Рейдер, также известный как БТК, признал себя виновным в убийстве 10 человек в течение 30 лет в районе Уичито, штат Канзас. Bo Rader File photo

После ареста Денниса Рейдера, суд над БТК

После того, как полиция арестовала Рейдера, они обнаружили оригинальные фотографии Вегерле и водительские права, прикрепленные к листу в запертой картотеке в его рабочем офисе.Он работал инспектором по соблюдению законов в Парк-Сити с 1991 года до своего увольнения через несколько дней после ареста.

Рейдер был настолько внимателен к деталям, что держал папки для связи.

Рейдер спрятал в своем доме некоторые улики, в том числе то, что лейтенант Кен Ландвер назвал «пакетом Виана». Но в основном он общался либо в закрытом рабочем шкафу, либо на рабочем компьютере.

Остается вопрос, убил ли Рейдер более 10 человек. «Я никогда не скажу никогда», — сказал Ландвер.Но следователи не считают, что убийств БТК станет больше, сказал он.

После ареста 25 февраля 2005 года Рейдер содержался в следственном изоляторе для взрослых округа Седжвик под залог в размере 10 миллионов долларов.

Его первая явка в суд состоялась 1 марта 2005 года перед окружным судьей округа Седжвик Грегом Уоллером. Он появился на закрытом телевидении из тюрьмы, что является стандартной практикой для первых слушаний в суде для заключенных, содержащихся под стражей в округе Седжвик.

Во время слушания он произнес менее двух десятков слов.

Такое громкое дело, как дело Рейдера, охватывающее 31 год, 10 жертв и семь различных сцен убийств, по оценкам юридических экспертов, обошлось штату Канзас в миллионы долларов.

Новостные организации со всего мира следили за этим делом; Здание суда округа Седжвик должно было приспособить для вещания и печати новостные СМИ для распространения информации по всему миру.

Судебные документы, запечатанные судьей Уоллером, заставили общественность и средства массовой информации задуматься о том, какие доказательства и доказательства имели власти, которые привели к аресту Рейдера в тот роковой февральский день.

Рейдер отказался от предварительного слушания 19 апреля и попросил отложить рассмотрение его заявления на 10 дней. После того, как Wichita Eagle и пять других новостных организаций обратились к судье с просьбой открыть судебные файлы по делу БТК, судья Уоллер снял печати почти со всех ходатайств и распоряжений по делу о множественных убийствах.

При кратком предъявлении обвинения Рейдеру 2 мая 2005 г. обвинения были официально оглашены. Он молчал, пока окружной судья Грег Уоллер не признал себя виновным от его имени. В то время окружной прокурор Нола Фоулстон уведомила о своем намерении отбыть наказание в виде тюремного заключения Hard 40.

27 июня 2005 года Деннис Рейдер, бывший лидер церкви и лидер бойскаутов, признал себя виновным как печально известный серийный убийца БТК в Уичито. Затем он подробно рассказал о том, как он выбрал, выследил и задушил 10 человек.

В зале суда члены семей потерпевших могли только молча слушать, как они слышали, что случилось с их близкими.

«Я назвал их проектами», — сказал Рейдер о 10 убийствах.

Он разделил каждую на ступеньки.

«Если вы много читали о серийных убийцах, вы знаете, что они проходят фазы», ​​- сказал Рейдер судье Уоллеру.«Троллинг — это один из этапов поиска жертв».

Для Рейдера это были женщины, о которых он питал жестокие сексуальные фантазии. 10 люди с 1974 по 1991 год. Она хотела, чтобы запись была точной в случае пересмотра вышестоящими судами.

Информация, которую она представила, включала графические свидетельства и фотографии пыток, которым подвергался Рейдер.

Освещение приговора

«Зло Рейдера на всеобщее обозрение», 17 августа 2005 г. — https://www.kansas.com/news/special-reports/btk/article1003771.html

«Семьи противостоят БТК in Court », 18 августа 2005 г. — https://www.cbsnews.com/news/families-confront-btk-in-court/

Интервью Д. А. Фулстона с CNN, 18 августа 2005 г. — http: / /www.cnn.com/2005/LAW/08/18/cnna.foulston /

BTK приговорен к 10 пожизненным срокам, CNN, 18 августа 2005 г. — http://www.cnn.com/2005/LAW/08/18/btk.killings/

Осужденный серийный убийца Деннис Рейдер, известный как душитель БТК входит в исправительное учреждение Эльдорадо с двумя заместителями шерифа округа Седжвик в пятницу, 19 августа 2005 г., в Эльдорадо, штат Канзас. Рейдер был признан виновным в убийстве 10 человек за 30 лет и приговорен к 10 пожизненным срокам заключения подряд. Архивное фото

Где сейчас Деннис Рейдер?

Деннис Линн Рейдер, родился 9 марта 1945 г., был приговорен к приговору.17 января 2005 г., по 10 обвинительным приговорам за убийство первой степени, за смерть 15 января 1974 г. (4 пункта), 4 апреля 1974 г., 17 марта 1977 г., 8 декабря 1977 г., 28 апреля 1985 г., 16 сентября , 1986 и 19 января 1991.

Он содержится в исправительном учреждении Эльдорадо на юге центральной части Канзаса.

Департамент исправительных учреждений Канзаса установил дату права на условно-досрочное освобождение для Рейдера 26 февраля 2180 года — 175 лет со дня его ареста. Согласно веб-сайту KDOC, уровень содержания под стражей Рейдера — «особый порядок», что означает, что он изолирован от общего числа заключенных.

Он не подлежит смертной казни. С 1972 по 1994 год в Канзасе не было смертной казни. Первые четыре убийства семьи Джозефа Отеро Рейдер совершил в 1974 году, а последнее — в 1991 году.

Книги, написанные о BTK:

▪ «Bind , Пытки, Убить: Внутренняя история серийного убийцы по соседству », 31 мая 2007 г., написано Херстом Лавианом, Роем Венцлем, Тимом Поттером, Л. Келли

▪ Роберт Битти, юрист из Уичито,« Кошмар в Уичито: The Охота на душителя БТК »- вышел в марте 2005 г.

По словам детектива, БТК двигали двумя вещами: извращениями, которые привели к убийствам, и жаждой внимания, побудившей его посылать письма в средства массовой информации.

Изучение книги Битти побудило Рейдера вернуться на поверхность после многих лет молчания. Полиция не сомневается в том, что возвращение Рейдера на поверхность в конечном итоге привело к его аресту.

▪ «Признание серийного убийцы: нераскрытая история Денниса Рейдера, убийцы БТК», написано Кэтрин Рамсленд

Телесериал

«Dateline NBC» — 12 августа 2005 г., интервью с Рейдером, проведенное Гарвардский нейропсихолог Роберт Мендоза

«BTK: Out Of The Shadows», интервью с семьей Вегерле, CBS 48 Hours, сентябрь.29, 2005

«Охота на убийцу БТК» — фильм CBS, 9 октября 2005 г.

«Мой отец БТК» — специальный выпуск новостей 2020 г., 1 февраля 2019 г.

Восемь из 10 человек, чьи смерти связаны от властей к серийному убийце БТК, в верхнем ряду слева: Джозеф Отеро и его жена Джули Отеро; Кэтрин Брайт; и Ширли Виан. В нижнем ряду слева: Нэнси Фокс, Марин Хедж, Вики Вегерле и Долорес Дэвис. Деннис Рейдер был признан виновным в их смерти.Фото из архива

Биографии жертв

Кэтрин Брайт

Кэтрин была членом класса Valley Center в 1971 году. Она училась в Канзасском университете на семестр, затем вернулась в Уичито, где устроилась на работу в Coleman. Ей был 21 год, когда ее убили.

В семье Брайтов было пятеро детей и 18 кузенов, которые часто собирались вместе. По словам ее двоюродной сестры Марсии Браун, это была близкая семья.

Кэтрин была радостной, красивой и запоминающейся, — сказал Браун. Из нее получилась бы отличная мама.

«Если она не смешила меня, она смеялась сама. Она была такой свободной душой ».

Долорес Дэвис

Эми Дэвис помнит сумасшедшие вещи, которые делала бабушка.

То, как она везде носила влажные салфетки, чтобы вытереть любую поверхность, в том числе лица, которая могла быть заражена микробом.

Как она «прятала» спички на холодильнике, даже когда ее дети выросли.

То, как она опускала окна машины на дюйм или два, не больше, из опасения, что ее внуков может высосать вакуум.

«Катись, бабушка!» дети кричали с заднего сиденья. «Можешь еще немного скатить его?»

«Нет, хватит», — говорила она. Потом она напевала мелодию и продолжала ехать.

Долорес «Ди» Дэвис в этом смысле была забавной, — сказала Эми.

Дэвис родился 6 июня 1928 года в Стелле, штат Небраска, и вырос на ферме.

Ди более 25 лет проработала секретарем в компании Lario Oil & Gas Co. Она вышла на пенсию в 1990 году, всего за несколько месяцев до смерти.

Она также продавала косметику Mary Kay®. По словам Эми, ей понравилось, что компания не тестировала свою продукцию на животных.

Нэнси Фокс

Большинство людей, знавших Нэнси Фокс из Южной средней школы, вспоминали, что она была умной, но ей также нравилось шутить.

Она была работягой. Она работала секретарем на полную ставку в строительном бизнесе The Law Co., а также работала два дня в неделю и несколько субботних дней в магазине Helzberg Jewelers в торговом центре Wichita Mall.

В магазине она работала в офисе вместе с Синди Дакетт, заполняя документы, чтобы изменить размер колец и часов или положить предметы на склад. Дакетт вспоминает, что Фокс был профессионалом и всегда хотел работать еще больше часов.

«Она много улыбалась, много шутила, — сказал Дакетт.«Она действительно беспокоилась. Ей нужно было платить по счетам, и она несла ответственность за себя. Она была более зрелой, чем остальные девушки ».

Marine Hedge

Мягким южным голосом, напоминающим ее корни в Арканзасе, Марин Хедж всегда предваряла каждое предложение фразой «говорит хорошо».

«А потом она просто заговорила», — сказала ее невестка Филлис Хедж. «Она говорила как Долли Партон. Она была удивительно мила ».

Миниатюрная женщина, Хедж любила покупки и украшения.Она всегда была тщательно одета, ее туфли соответствовали ее одежде.

«Она была очень стильной, — сказала Филлис Хедж, которая знала ее 18 лет. «Просто идеальный, дотошный маленький человек. Ее рост был ниже пяти футов «.

Хедж, девичья фамилия которой была Уоллес, переехала со своим мужем в Канзас из Арканзаса. Он работал в Beechcraft. Более десяти лет она проработала начальником второй смены в кофейне медицинского центра Уэсли.

Они жили на улице Независимости 6254 в Парк-Сити.У них были один сын и три дочери, а также внуки.

Ее муж умер на год раньше нее. Во время ее смерти соседи вспоминали, что она наслаждалась лото, работая во дворе и посещая баптистскую церковь Парк-Сити.

Джозеф Отеро

Там был Джозеф Отеро, отец — иногда суровый с большими надеждами на своих пятерых детей. Таблицы успеваемости с необходимыми объяснениями Б.

Затем был Джозеф Отеро, человек, помешанный на авиации и автомобилях, талантливый игрок на бонго, флирт, нарезка.

Чарли Отеро помнит обе стороны своего отца. В 15-летнем возрасте он только начинал сближаться со своим отцом, когда Джозеф умер в 1974 году в возрасте 38 лет.

«Он был душой компании», — сказал Чарли. «Если бы в комнате было 20 парней, он был бы посередине, заставляя их всех смеяться, рассказывать истории, подшучивать над людьми, флиртовать с девушками. Он не был застенчивым человеком ».

Отеро родился в Пуэрто-Рико и в детстве иммигрировал в Соединенные Штаты.

Он вырос в испанском Гарлеме Нью-Йорка, где стал чемпионом по боксу и влюбился в Джули, девушку из соседнего района и еще одну пуэрториканскую пересадку.

Как только Отеро стал достаточно взрослым, он поступил в ВВС, где прослужил 20 лет. Он ушел в отставку с должности старшего сержанта незадолго до того, как осенью 1973 года перевез свою семью в Уичито.

Джули Отеро

Джули Отеро, 34-летняя мать пятерых детей, была миниатюрной и весила всего около 100 фунтов. . И она была мила, как ангел, сказал ее сын Чарли.

Но в ее ангельской внешности буквально скрывался внутренний боец.

Давняя жена ВВС, Джули Отеро записала всю свою семью на летние занятия дзюдо, которые проводятся на базе.Она считала уроки чем-то, чем она и ее дети могут заниматься вместе.

В мгновение ока Джули стала коричневым поясом, и ее дети выигрывали трофей за трофеем.

«Но она все время была дамой».

Джули родилась в Пуэрто-Рико. По словам ее сына, она приехала в Соединенные Штаты на банановой лодке в детстве.

Общительная, общительная и популярная, она быстро привлекла внимание Джозефа Отеро, который гнался за ней годами. Они поженились на большом венчании в церкви в Нью-Йорке, и Чарли родился «почти девять месяцев спустя».”

Когда семья переехала в Уичито, Джули устроилась на сборочную линию в Coleman. Примерно через месяц ее уволили из-за сокращения рабочей силы. Ее рекомендовали на повторный прием.

Жозефина Отеро

Одиннадцатилетняя Жозефина Отеро была известна как «новая девочка» среди своих шестиклассников в начальной школе Адамса осенью 1973 года.

Она пошла в школу после начала семестра — то, что привлекает внимание из комнаты, полной 11–12-летних.

Они звали ее Джози.

Джози была тихой и застенчивой, но добродушной, вспоминает одноклассник Билл Партридж.

Она просто смеялась, когда другие дети пели ей музыкальную тему из популярного в то время мультфильма «Джози и кошечки».

Чарли Отеро вспоминает свою младшую сестру красивой и худенькой с длинными темными волосами.

Она была лучшей ученицей в семье. Несмотря на наличие желтого пояса по дзюдо, она глубоко укоренилась в своей «девчачьей жизни».«Ей нравились ее куклы Барби. Она писала стихи. Рисовала и рисовала.

Она была неразлучна со своей старшей сестрой Кармен, единственной девушкой в ​​семье.

Джозеф Отеро II

Джозеф Отеро II был младенцем в семье, но младенцем не было.

Известный как Джоуи, четверо старших братьев и сестер редко оставляли его одного.

«Джоуи был любимцем семьи», — вспоминает его брат Чарли. «Все играли с Джоуи, использовали его на тренировках по дзюдо.Мы заставим собаку таскать его по дому. Но все было влюблено ».

В возрасте 9 лет Джои быстро стал одним из самых популярных мальчиков в четвертом классе начальной школы Адамса.

Он начал учебный год поздно, и девочки в его классе сразу же влюбились в него.

«Он был хорош — голливудски хорош, — сказал Чарли, на шесть лет старше Джоуи. «У него уже были разные подруги. Толпы их преследовали его повсюду ».

Семейная собака Лаки была подарком Джои на его пятый день рождения.Хотя пастушья смесь могла быть свирепой по отношению к незнакомцам, Джои любил его.

«Все, что нам нужно было сделать, это просто повезло с Джоуи, — сказал Чарли, — и он схватил его за штанину и тащил по всему дому».

Ширли Виан

Сын Ширли Виан, Стивен Релфорд, вспоминает о своей матери, так это то, что она пела в церковном хоре. Ей нравилось петь.

«Она была хорошей матерью», — сказала Релфорд, которой было всего 5 лет, когда она умерла. «Она всегда казалась счастливой».

У Виан было трое детей: Бад, Стивен и Стефани.

Вики Вегерле

Вики Вегерле любила детей — своих и других, — говорят те, кто ее знал.

Вики Вегерле вызвалась нянькой в ​​лютеранской церкви Св. Андрея, которую она регулярно посещала, и в Объединенной методистской церкви Эсбери, которая находилась по соседству с ней.

Преподобный Арно Мейер был пастором церкви Святого Андрея в 1986 году, когда был убит Вегерле.

«Она была замечательной женщиной», — сказала Мейер, которая сейчас на пенсии и живет в Топике.«Она была просто матерью с мягкими манерами, тихой и любящей».

Подпись

В течение 31 года она оставалась одной из самых тщательно охраняемых тайн в деле о серийном убийстве БТК.

Полиция Уичито использовала его для проверки того, что сообщения, отправленные в полицию и средства массовой информации, действительно исходили от убийцы. Они держали это в секрете, чтобы его не использовали в розыгрыше.

Это была подпись серийного убийцы — сексуально наводящий на размышления набор букв «B», «T» и «K», все еще оставшийся в памяти некоторых бывших сыщиков.

Вместо того, чтобы писать буквы в линию слева направо, убийца сложил буквы «Б», «Т» и «К» сверху вниз, так чтобы буква «В» выглядела как женская грудь.

Тони Руарк, психолог из Уичито, консультировавшийся с полицией по делу БТК с 1979 по 1981 год, вспоминает, что ему велели хранить уникальную подпись в секрете.

«Это единственная вещь, от которой невозможно избавиться», — сказал он.

Лишь ограниченное количество детективов обратило на это внимание.

«Я никогда никому об этом не рассказывал, — сказал он.

Согласно исследованию Роберта Битти, человека из Уичито, написавшего книгу об этом деле, подпись фигурировала в двух из пяти известных сообщений убийцы с 1974 по 1979 год.

Подпись также была обнаружена на письме, которое было доставлено в The Wichita Eagle в марте 2004 года.

По запросу полиции Уичито, The Eagle согласился не описывать подпись. Если это станет достоянием общественности, заявила полиция, будет намного сложнее отсеять буквы-подражатели.

BTK TIMELINE

15 января 1974 — Джозеф и Джули Отеро задушены в своем доме по адресу 803 N. Edgemoor вместе с двумя своими детьми, Жозефиной, 11 лет, и Джозефом II, 9 лет. магазин Диллонс в Центре и Оливере.

4 апреля 1974 — Кэтрин Брайт, 21, найдена зарезанной в своем доме по адресу 3217 E. 13-я улица Полиция позже пришла к выводу, что она была жертвой БТК.

,

, октябрь 1974 г. — Wichita Eagle-Beacon получает письмо от человека, утверждающего, что он убил Отеро.В письме содержались подробности с места преступления, которые мог знать только убийца.

17 марта 1977 — Ширли Виан, 26 лет, найдена связанной и задушенной в своем доме на 1311 S. Гидравлич.

8 декабря 1977 — 25-летняя Нэнси Фокс найдена связанной и задушенной в своем доме на 843 С. Першинг. Голос БТК записывается на пленку, когда он звонит диспетчеру, чтобы сообщить об убийстве.

31 января 1978 — Стихотворение, написанное детским печатным набором на каталожной карточке, прибывает в Wichita Eagle-Beacon.Стихотворение, созданное по образцу детского стишка «Кудрявые локоны», относится к убийству в Виане.

10 февраля 1978 — В КАКЕ приходит письмо от БТК, в котором он берет на себя ответственность за смерть Виан и Фокса, а также еще одной неназванной жертвы. На поспешно организованной пресс-конференции начальник полиции Ричард Ламуньон объявляет, что серийный убийца находится на свободе и пригрозил нанести новый удар.

28 апреля 1979 г. — Убийца ждет в доме в 600-м квартале Саут-Пайнкрест, но уезжает до того, как возвращается 63-летняя хозяйка дома.Позже он отправляет женщине письмо, в котором сообщает, что был там. Полиция считает, что убийца нацелился на дочь женщины.

15 августа 1979 — Уичитанцы слушают неоднократные радио- и телетрансляции голоса душителя БТК из телефонного разговора 1977 года. Полиция получает 110 подсказок в первый день эфира.

Середина 1980-х — новое расследование BTK начинает группа, известная как «Охотники за привидениями», которые в течение трех лет используют новые методы, включая тестирование ДНК, поиск в компьютерных базах данных и психологические профили.

27 апреля 1985 г. — Марин Хедж, которая жила чуть ниже Индепенденс-стрит от Денниса Рейдера в Парк-Сити, связана и убита в своем доме.

16 сентября 1986 — 28-летняя Вики Вегерле задушена в своем доме на улице 2404 W., 13-я улица. Семейный автомобиль найден в двух кварталах от дома в 1300 квартале Норт-Эдвардс.

Январь 1988 г. — жена потерпевшего от убийства Филиппа Фагера получает письмо от мужчины, утверждающего, что он является БТК. В письме говорилось об убийстве Фагера и двух его дочерей, но эксперты БТК расходятся во мнении, действительно ли это было совершено БТК.

19 января 1991 г. — Рейдер убивает Долорес «Ди» Дэвис и оставляет ее тело в канаве

19 марта 2004 г. — В отель Wichita Eagle приходит письмо, содержащее ксерокопию водительских прав Вегерле и три фотографии, которые, по-видимому, были сделаны. убийцей. Родственники говорят, что в доме Вегерле не хватало лицензии.

ССЫЛКИ НА ПРОШЛОЕ ПОКРЫТИЕ

Специальный онлайн-раздел Eagle: https://www.kansas.com/news/special-reports/btk/

Дело BTK не раскрыто, 30 лет спустя: https: // www.kansas.com/news/special-reports/btk/article1003802.html

Эксклюзивное интервью с дочерью БТК: https://www.kansas.com/news/special-reports/btk/article10809929.html

Стенограмма показаний БТК : https://www.kansas.com/news/special-reports/btk/article225087595.html

Книга дочери БТК будет опубликована: https://www.kansas.com/news/special-reports/btk /article2025.html

Исторические фотографии убийств БТК и процесса: https: //www.kansas.com / news / special-reports / btk / article10767731.html

Изначально эта история была опубликована 25 января 2019 г., 18:08.

Связанные истории из Уичито Игл

Скрининг мутаций гена BTK в 56 семьях с Х-сцепленной агаммаглобулинемией (XLA): 47 уникальных мутаций без корреляции с клиническим течением

Цели: Чтобы определить полезность анализа одноцепочечного конформационного полиморфизма (SSCP) для скрининга мутаций в гене BTK (тирозинкиназа Брутона), мы исследовали 56 семейств Х-сцепленной агаммаглобулинемии (XLA).Для получения корреляций генотип / фенотип предсказанные белковые аберрации коррелировали с клиническим течением заболевания.

Пациенты: В это исследование вошли 56 пациентов с XLA, с положительным семейным анамнезом или без него, которым был поставлен диагноз на основании их клинических особенностей, низкого количества периферических B-клеток и низкого уровня иммуноглобулина. Контрольной группой служили 10 пациентов с изолированной гипогаммаглобулинемией и 50 здоровых мужчин.

Методы: SSCP-анализ был выполнен для всего гена BTK, включая границы экзон-интрон и промоторную область. Структурные последствия миссенс-мутаций были исследованы с помощью молекулярного моделирования, а функциональные последствия некоторых мутаций также были оценены с помощью анализов киназ in vitro и вестерн-блоттинга.

Полученные результаты: Мы сообщаем о самой большой серии пациентов с XLA на сегодняшний день.У всех, кроме 5 из 56 индексных пациентов с XLA, проверенных с помощью анализа SSCP, были выявлены аномалии гена BTK, а у 2 из 5 SSCP-отрицательных пациентов белок BTK не был обнаружен с помощью вестерн-блоттинга. Была обнаружена 51 мутация, в том числе 37 новых, распределенных по всему гену. Этот отчет содержит первую промоторную мутацию, а также 14 новых миссенс-мутаций, первые из которых описаны для домена гомологии Tec и богатого глицином мотива в домене Sh2. У каждого индексного пациента была своя мутация, за исключением четырех мутаций, каждая у двух неродственных людей.Этот результат подтверждает сильную тенденцию к частным мутациям при этом заболевании. В контроле мутаций не обнаружено.

Выводы: Наши результаты демонстрируют, что молекулярно-генетическое тестирование с помощью анализа SSCP обеспечивает точный инструмент для окончательного диагноза XLA и выявления пограничных случаев, таких как определенная гипогаммаглобулинемия или пациентов с общим вариабельным иммунодефицитом с частично совпадающими клиническими признаками.В настоящее время корреляция генотип / фенотип невозможна, что делает невозможным прогнозирование клинического течения болезни на основе молекулярно-генетических данных.

Тирозинкиназа Btk регулирует активацию интегрина, опосредованную Е-селектином, и рекрутирование нейтрофилов, контролируя пути фосфолипазы C (PLC) γ2 и PI3Kγ | Кровь

Рекрутирование лейкоцитов в воспаленную ткань необходимо для защиты хозяина и происходит в скоординированной последовательности различных шагов.Первый контакт нейтрофилов с эндотелием опосредуется селектинами и их контррецепторами, за которым следует сворачивание и опосредованная интегрином остановка. Во время катания нейтрофилы собирают различные воспалительные сигналы, которые могут активировать несколько путей и опосредовать активацию интегрина, остановку, ползание и экстравазацию лейкоцитов в воспаленную ткань. 1

E-селектин экспрессируется на воспаленных эндотелиальных клетках и может связываться с различными гликозилированными лигандами на лейкоцитах, включая CD44, 2 P-селектин гликопротеиновый лиганд-1 (PSGL-1), 3 CD43, 4 E-селектин лиганд-1 (ESL-1), 5 макрофагальный антиген-1 (Mac-1; α M β 2 ), 6 и другие неизвестные лиганды.Включение E-селектина вызывает активацию иммунорецепторного тирозинового мотива активации семейства Src (ITAM), содержащего адаптерный белок-сигнальный путь Syk, который индуцирует медленное вращение, зависимое от функции лимфоцитов, связанный с антигеном-1 (LFA-1). in vitro и in vivo. 7,8 Selplg — / — и Syk — / — нейтрофилы не могут снизить свою скорость катания при катании по E-селектину и молекуле межклеточной адгезии-1 (ICAM-1) в экспериментах с проточной камерой. 8 В нейтрофилах мышей Tyrobp — / — Fcrg — / — (с дефицитом DAP12 и FcRγ) взаимодействие E-селектина не способно фосфорилировать Syk и не вызывает медленного катания. 7 Связывание нейтрофилов с E-селектином под действием сдвига вызывает фосфорилирование митоген-активируемой протеинкиназы p38 (p38 MAPK), 7 и блокирование p38 MAPK увеличивает скорость вращения E-селектина и ICAM-1 по сравнению с контроль. 8 Блокирование p38 MAPK в изолированных нейтрофилах человека ингибирует их адгезию к клеткам, трансфицированным E-селектином и ICAM-1. 9

Нейтрофилы в основном экспрессируют 2 β 2 -интегринов, LFA-1 (α L β 2 ) и Mac-1 (α M β 2 ), которые регулируют скорость вращения лейкоцитов в посткапиллярных венулах. кремастера после инъекции TNF-α. 10 В экспериментах с автоперфузией проточной камеры нейтрофилы демонстрируют пониженную скорость вращения на E-селектине и ICAM-1 по сравнению с одним E-селектином. 8 Медленное вращение, опосредованное E-селектином, зависит от LFA-1. 8 LFA-1 может подвергаться частичной активации до состояния с промежуточным сродством или полной активации до состояния с высоким сродством. 11 Стабилизация LFA-1 в расширенной конформации, связанной с промежуточной аффинностью 11 все еще позволяет LFA-1-зависимое медленное катание на E-селектине и ICAM-1, но ингибирует индуцированную хемокинами прочную адгезию. 8 Однако дистальный путь передачи сигналов, связывающий Syk с LFA-1, интегрином, ответственным за контроль скорости вращения на E-selectin и ICAM-1, 8 , все еще неизвестен.

Тирозинкиназа Bruton (Btk), член киназ семейства Tec, имеет уникальную Nh3-концевую область, содержащую домен гомологии плекстрина (PH) и богатый пролином участок, за которым следует Src-гомология 3 (Sh4), Sh3, и киназные домены (обзор см. в Mohamed et al., , 12, ). Известно, что Btk участвует в регуляции передачи сигналов через рецептор B-клеток (BCR), 13 , и дефекты в этой молекуле приводят к X-связанной агаммаглобулинемии у людей. 14 После вовлечения BCR Btk перемещается на плазматическую мембрану, где фосфорилируется киназами семейства Src. 12 Поскольку Btk является многодоменным белком, он может взаимодействовать и активировать различные молекулы, включая фосфолипазу C (PLC) γ2. Btk также экспрессируется в миелоидном клоне, 15,16 и эксперименты с ген-дефицитными мышами или ингибиторами показывают, что Btk в нейтрофилах участвует в передаче сигналов рецепторов, связанных с G-белками, и в других функциях. 17,18 Недавно опубликованная статья продемонстрировала, что Btk-дефицитные мыши имеют сниженный воспалительный ответ в сложных моделях заболеваний из-за дефекта рекрутирования лейкоцитов. 19

PLCγ является членом семейства фосфоинозитид-специфичных PLC (PI-PLC), которые катализируют расщепление фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфата (PIP2) до диацилглицерина (DAG) и инозитол-3,4,5-трифосфата (IP 3 ), вызывая последующую активацию протеинкиназы C (PKC) и повышение уровня внутриклеточного кальция. 20 Есть 2 изоформы PLCγ, PLCγ1 и PLCγ2. PLCγ1 экспрессируется повсеместно, но экспрессия PLCγ2 в первую очередь ограничена клетками гемопоэтического клона. 20 PLCγ имеет доменную структуру, общую для других PLC млекопитающих, состоящую из каталитической области, аминоконцевого домена PH, ряда сторон EF и домена гомологии PKC (C2). Каталитический домен разделен на 2 области, соединенные линкером X / Y, и является сайтом продукции DAG и IP 3 .Особенности PLCγ, такие как дополнительные домены, расположенные между каталитическими областями X и Y, отделяют их от других изоформ PLC и отвечают за их регуляцию с помощью тирозинкиназ. PLCγ может активироваться как рецепторными, так и нерецепторными тирозинкиназами. Было показано, что PLCγ2 участвует в опосредованной Fcϵ рецептором дегрануляции тучных клеток 21 и передаче сигналов интегрина в тромбоцитах 22,23 , а также в нейтрофилах. 24 Недавно опубликованное исследование продемонстрировало, что PLCγ2 критически участвует в функциях нейтрофилов, опосредованных интегрином и рецептором Fc. 25

Фосфоинозитид-3-киназы (PI3K) — важные клеточные липидкиназы, которые конвертируют PIP2 в PIP3, второго мессенджера, важного для различных клеточных функций и ответов. Члены семейства PI3K состоят из регуляторной субъединицы (p85α, p85β или p55γ) и каталитической субъединицы (p110α, p110β, p110γ или p110δ). 26 PI3Kγ в основном экспрессируется в лейкоцитах и ​​активируется с помощью передачи сигналов рецептора, связанного с G-белком, через субъединицу βγ. 27,28 Предыдущие исследования PI3Kγ были сосредоточены на его функции в активации, миграции и выработке супероксида лейкоцитов. Лейкоциты, лишенные PI3Kγ, демонстрируют нарушенный респираторный взрыв, 29 дефект устойчивой адгезии после остановки, 30 снижение хемотаксического ответа на ряд хемоаттрактантов, 29,31 и ослабление рекрутирования лейкоцитов в воспаленную ткань. 29,31,32

Настоящее исследование было разработано для идентификации индуцированного E-селектином сигнального пути, связывающего Syk с β 2 -интегринами.Используя анализы проточной камеры ex vivo, анализы фосфорилирования in vitro в нейтрофилах и эксперименты с воспалением in vivo с несколькими генно-направленными линиями мышей, мы обнаружили, что сигнальный путь ниже Syk делится на PLCγ2- и PI3Kγ-зависимые пути. Активация этих путей контролируется киназой семейства Tec Btk, которая необходима для медленного катания, опосредованного E-selectin.

мышей C57BL / 6 в возрасте от 8 до 12 недель (Janvier), Plcg2 — / — мышей, 21 Pik3cg — / — мышей, 29 Itgb2 — / Itgb2 — / — / , 33 Syk — / — мышей, 34 и Btk — / — мышей (The Jackson Laboratory) содержали в специальном помещении, свободном от патогенов.Комитеты по уходу за животными и их использованию Университета Мюнстера (Германия) одобрили все эксперименты на животных.

Для получения дополнительной информации о создании химер костного мозга, анализе с автоперфузией проточной камеры, модели перитонита, анализе взаимодействия селектина и измерении IP 3 см. Дополнительные методы (доступны на веб-сайте Blood ; см. Ссылка на дополнительные материалы вверху онлайн-статьи).

За 2 часа до экстериоризации мышц кремастера мышам в мошонку вводили 500 нг TNF-α (R&D Systems) в 0,3 мл физиологического раствора. Некоторым животным также делали инъекции в хвостовую вену 4 мкг коклюшного токсина (PTx; Sigma-Aldrich), суспендированного в 0,3 мл физиологического раствора, за 5 минут до инъекции TNF-α. Мышей анестезировали с помощью внутрибрюшинной инъекции гидрохлорида кетамина (125 мг / кг; Sanofi Winthrop Pharmaceuticals), ксилазина (12.5 мг / кг; Транкви Вед; Phonix Scientific) и сульфат атропина (0,025 мг / кг; Fujisawa), и кремастерную мышцу готовили для прижизненной визуализации, как описано ранее. 7,8 Прижизненную микроскопию выполняли на прямом микроскопе (Axioskop; Carl Zeiss) с иммерсионным объективом 40 × 0,75 NA. Скорость катания лейкоцитов, фракцию катящегося потока лейкоцитов и остановку лейкоцитов определяли с помощью трансиллюминационной прижизненной микроскопии, тогда как экстравазацию лейкоцитов исследовали с помощью наклонной трансиллюминационной микроскопии в отраженном свете, как описано ранее. 37 Записанные изображения были проанализированы в автономном режиме с использованием программного обеспечения ImageJ и AxioVision (Carl Zeiss). Фракцию катящегося потока лейкоцитов рассчитывали как процент от общего потока лейкоцитов. Эмигрировавшие клетки определяли в области, достигающей 75 мкм с каждой стороны сосуда на расстоянии 100 мкм длины сосуда (что составляет 1,5 × 10 4 мкм 2 площади ткани). Микроциркуляцию регистрировали с помощью цифровой камеры (Sensicam QE). Были исследованы посткапиллярные венулы диаметром от 20 до 40 мкм.Среднюю скорость кровотока измеряли с помощью системы двойных фотодиодных датчиков (Circusoft Instrumentation). Средние скорости были преобразованы в средние скорости кровотока путем умножения на эмпирический коэффициент 0,625. 8

Было показано, что Btk — / — мышей имеют дефект рекрутирования лейкоцитов на сложных моделях заболевания. 19 Чтобы проверить, участвует ли Btk в медленном вращении, опосредованном E-селектином, мы исследовали скорость вращения нейтрофилов у Btk — / — мышей и мышей дикого типа (WT) в проточной камере с автоперфузией.Преимущество этой системы состоит в том, что нейтрофилы можно исследовать в цельной крови без выделения клеток. Мы продемонстрировали 7,8 , что скорость катания нейтрофилов WT на проточных камерах с автоперфузией, покрытых E-селектином и ICAM-1, значительно снижена по сравнению с одним E-селектином. 7,8 Btk — / — нейтрофилы показали такую ​​же скорость вращения на E-селектине, что и нейтрофилы WT, но не смогли снизить скорость их вращения на E-селектине плюс ICAM-1 (рис. 1A).Для подтверждения этих данных выделенные нейтрофилы костного мозга 7 перфузировали через проточную камеру, покрытую либо E-селектином, либо E-селектином плюс ICAM-1, и определяли скорость вращения. Нейтрофилы мышей WT показали снижение скорости вращения на E-селектине и ICAM-1 по сравнению с одним E-селектином, но нейтрофилы от мышей Btk — / — не смогли снизить скорость вращения на E-селектине и ICAM. -1 (Рисунок 1B).

Рисунок 1

Киназа Btk семейства Tec необходима для медленного скатывания, опосредованного Е-селектином, и Gα i -независимой адгезии, но не для индуцированного хемокинами ареста in vivo .(A) Сонная артерия химерных мышей, восстановленная костным мозгом мышей WT (n = 3) или Btk — / — мышей (n = 3), была канюлирована с помощью катетера, который был подключен к проточным камерам с автоперфузией. Средняя скорость катания нейтрофилов по E-селектину (слева), E-селектину и ICAM-1 (справа) представлена ​​как среднее значение ± SEM. Напряжение сдвига стенки во всех экспериментах с проточной камерой составляло от 5 до 6 дин / см 2 . (B) Выделенные нейтрофилы костного мозга ресуспендировали в плазме и измеряли скорость вращения либо для одного E-селектина, либо для E-селектина плюс ICAM-1.В этих экспериментах было использовано напряжение сдвига 3 дин / см 2 (n = 3). (C) Смешанных химерных мышей получали путем инъекции клеток костного мозга мышей WT LysM-GFP + и мышей Btk — / — смертельно облученным мышам WT. Кумулятивная гистограмма скоростей качения 100 GFP + (WT; ●) и 100 GFP ( Btk — / — ; ○) лейкоцитов в воспаленных венулах кремастерной мышцы смешанных химерных мышей (n = 4), подвергшихся лечению с PTx и моноклональным блокирующим P-селектином антителом (RB40.34). Данные на вставке — это средние значения ± SEM. (D) Количество прикрепленных клеток на квадратный миллиметр в мышечных венулах кремастера мыши. Кремастерную мышцу экстериоризовали через 2 часа после интрамошонковой инъекции 500 нг TNF-α химерным мышам, восстановленным костным мозгом мышей WT или Btk — / — мышей. Пунктирная линия указывает количество адгезивных клеток у мышей WT, обработанных PTx и моноклональным блокирующим E-селектином антителом (9A9). № P <.05; * П <.05 по сравнению с другими группами.

Рисунок 1

Киназа семейства Tec Btk необходима для медленного скатывания, опосредованного Е-селектином, и Gα i -независимой адгезии, но не для индуцированного хемокинами ареста in vivo . (A) Сонная артерия химерных мышей, восстановленная костным мозгом мышей WT (n = 3) или Btk — / — мышей (n = 3), была канюлирована с помощью катетера, который был подключен к проточным камерам с автоперфузией. Средняя скорость катания нейтрофилов по E-селектину (слева), E-селектину и ICAM-1 (справа) представлена ​​как среднее значение ± SEM.Напряжение сдвига стенки во всех экспериментах с проточной камерой составляло от 5 до 6 дин / см 2 . (B) Выделенные нейтрофилы костного мозга ресуспендировали в плазме и измеряли скорость вращения либо для одного E-селектина, либо для E-селектина плюс ICAM-1. В этих экспериментах было использовано напряжение сдвига 3 дин / см 2 (n = 3). (C) Смешанных химерных мышей получали путем инъекции клеток костного мозга мышей WT LysM-GFP + и мышей Btk — / — смертельно облученным мышам WT.Кумулятивная гистограмма скоростей качения 100 GFP + (WT; ●) и 100 GFP ( Btk — / — ; ○) лейкоцитов в воспаленных венулах кремастерной мышцы смешанных химерных мышей (n = 4), подвергшихся лечению с PTx и моноклональным блокирующим P-селектином антителом (RB40.34). Данные на вставке — это средние значения ± SEM. (D) Количество прикрепленных клеток на квадратный миллиметр в мышечных венулах кремастера мыши. Кремастерную мышцу экстериоризовали через 2 часа после интрамошонковой инъекции 500 нг TNF-α химерным мышам, восстановленным костным мозгом мышей WT или Btk — / — мышей.Пунктирная линия указывает количество адгезивных клеток у мышей WT, обработанных PTx и моноклональным блокирующим E-селектином антителом (9A9). № P <.05; * P <0,05 по сравнению с другими группами.

Чтобы подтвердить наши данные о проточной камере, мы провели прижизненную микроскопию на смешанных химерных мышах, полученных путем инъекции клеток костного мозга от Btk — / — мышей (зеленый флуоресцентный белок отрицательный [GFP ]) и WT LysM-GFP + мышей 38 в смертельно облученных мышей WT.После инъекции TNF-α скорость перекатывания лейкоцитов была проанализирована в воспаленных венулах кремастерной мышцы после блокирования передачи сигналов Gα i и P-селектина, чтобы сфокусироваться на E-селектин-зависимом медленном катании. 8 Средняя скорость кровотока и скорость сдвига стенки в этих венулах составляли 2,6 мм / секунду плюс-минус 0,2 мм / секунду и 2100 секунд -1 плюс-минус 180 секунд -1 , соответственно. В этих условиях средняя скорость прокатки (V avg ) Btk — / — лейкоцитов in vivo составляла 7.9 мкм / сек плюс-минус 1,5 мкм / сек, тогда как средняя скорость прокатки контрольных лейкоцитов LysM-GFP + была значительно ниже (4,0 ± 1,0 мкм / с, P <0,05; рис. 1C). Скорость катания, наблюдаемая в лейкоцитах мышей Btk — / — , аналогична скорости катания лейкоцитов у мышей WT после блокирования LFA-1, интегрина, ответственного за снижение скорости катания на E-селектине и ICAM. -1. 8 Эти находки подтверждают, что Btk участвует в активации β 2 -интегрина и последующем медленном вращении после вовлечения E-selectin.

Переход от свертывания лейкоцитов к прочной адгезии после предварительной обработки TNF-α опосредуется перекрывающимся образом посредством передачи сигналов рецептора, связанного с G-белком, и E-селектина. 39 В соответствии с ранее опубликованным исследованием, 39 предварительная обработка мышей WT блокирующим антителом к ​​E-селектину (9A9) или PTx не повлияла на количество прикрепленных клеток (1173 ± 360 клеток / мм 2 и 990 ± 142 кл / мм 2 соответственно; данные не показаны).Блокирование передачи сигналов как Е-селектина, так и рецептора, связанного с G-белком, у мышей WT значительно снижает адгезию лейкоцитов (347 ± 172 клеток / мм 2 , P <0,05; пунктирная линия на рис. 1D). Btk — / — мыши показали такое же количество прикрепленных лейкоцитов, как и мыши WT, через 2 часа после инъекции TNF-α (фигура 1D). Блокирование E-селектина моноклональным антителом у мышей Btk — / — не изменило количество адгезивных клеток по сравнению с мышами WT, получавшими блокирующее антитело E-селектина (1003 ± 149 клеток / мм 2 и 1173 ± 360 кл / мм 2 соответственно).В отличие от мышей WT, блокирование передачи сигналов рецептора, связанного с G-белком, у мышей Btk — / — значительно снижает адгезию лейкоцитов после применения TNF-α (рис. 1D). Параметры микрососудов (диаметр сосудов, скорость по средней линии, скорость сдвига стенки) и количество лейкоцитов (WBC) были одинаковыми среди групп (данные не показаны). Эти данные указывают на то, что опосредованный E-selectin путь в Btk-дефицитных лейкоцитах является дефектным.

Чтобы проверить, участвует ли Btk в вызванной хемокинами остановке, мы провели прижизненную микроскопию необработанной мышцы кремастера. 8 В этой модели нейтрофилы катятся в венулах кремастера из-за экспрессии P-селектина на эндотелии, но прикрепляются редко. Инъекция 600 нг рекомбинантного мышиного CXCL1, который связывает CXCR2, индуцировала такое же количество прикрепленных лейкоцитов в венулах химерных мышей, восстановленных костным мозгом мышей WT, или мышей Btk — / — (272 ± 44 прикрепленных клеток / мм 2 и 271 ± 38 адгезивных клеток / мм 2 соответственно). Эти данные подтверждают, что Btk необходим для медленного катания, опосредованного E-selectin, но не участвует в индуцированной хемокинами остановке лейкоцитов.

В нескольких сигнальных путях иммунорецепторов PLCγ может быть активирован с помощью Btk. 12 Чтобы выяснить, участвует ли PLCγ2 в медленном вращении, опосредованном E-селектином, мы исследовали скорость вращения Plcg2 — / — и нейтрофилов WT с использованием проточной камеры с автоперфузией. Plcg2 — / — нейтрофилы показали меньшее снижение их скорости катания на E-селектине плюс ICAM-1 по сравнению с нейтрофилами от мышей WT, но медленное вращение, опосредованное E-селектином, не было полностью блокировано (Рисунок 2A).Эти данные подтверждают, что PLCγ2 только частично регулирует медленное вращение, обеспечиваемое E-selectin. Чтобы исследовать роль PLCγ2 в E-селектин-зависимом медленном вращении in vivo, мы выполнили прижизненную микроскопию на смешанных химерных мышах, полученных путем инъекции костного мозга мышей Plcg2 — / — и мышей LysM-GFP + с летальным исходом. облученных мышей WT. Чтобы исследовать медленное вращение, опосредованное Е-селектином, in vivo, мы заблокировали сопряженную с Gα i передачу сигналов и Р-селектин у мышей, получавших TNF-α.В индуцированных TNF-α воспаленных посткапиллярных венулах скорость катания лейкоцитов Plcg2 — / — составляла 6,4 мкм / с плюс-минус 1,1 мкм / с, что значительно выше скорости вращения LysM-GFP + контрольных лейкоцитов (4,2 ± 0,7 мкм / сек, P <0,05; рис. 2В). Чтобы показать, что лейкоциты Plcg2 — / — имеют частичный дефект, мы исследовали скорость вращения лейкоцитов Syk — / — in vivo.В предыдущем исследовании мы продемонстрировали, что Syk необходим для активации интегрина после вовлечения E-selectin. 8 По сравнению с лейкоцитами Plcg2 — / — , скорость вращения лейкоцитов Syk — / — еще больше увеличивается (рис. 2В). Эти находки показывают, что активация β 2 -интегрина после вовлечения E-selectin частично регулируется с помощью PLCγ2.

Рисунок 2

Элиминация PLCγ2 частично устраняет медленное вращение, опосредованное Е-селектином, и, следовательно, снижает адгезию лейкоцитов in vivo .(A) Канюли сонной артерии помещали химерным мышам, восстановленным костным мозгом от Plcg2 — / — мышей (n = 3) или мышей WT (n = 3), и подсоединяли к проточным камерам с автоперфузией. Средняя скорость катания нейтрофилов по E-селектину (слева), E-селектину и ICAM-1 (справа) представлена ​​как среднее значение ± SEM. Напряжение сдвига стенки во всех экспериментах с проточной камерой составляло от 5 до 6 дин / см 2 . (B) Смешанные химерные мыши были получены путем инъекции клеток костного мозга мышей LysM-GFP + WT и мышей Plcg2 — / — или мышей Syk — / — смертельно облученным мышам WT.Кумулятивная гистограмма скоростей качения 150 лейкоцитов WT (●), 150 Plcg2 — / — лейкоцитов (▾) и 150 Syk — / — лейкоцитов (○) в воспаленных венулах мышц кремастера смешанных химерных мышей (n = 4) лечили PTx и моноклональным блокирующим P-селектином антителом (RB40.34). Данные на вставке — это средние значения ± SEM. (C) Количество прикрепленных клеток на квадратный миллиметр в мышечных венулах кремастера мыши. Мышца Cremaster экструдировали через 2 часа после интрамошонковой инъекции 500 нг TNF-α химерным мышам, восстановленным костным мозгом мышей WT или Btk — / — мышей.Пунктирная линия указывает количество адгезивных клеток у мышей WT, обработанных PTx и моноклональным блокирующим E-селектином антителом (9A9). № P <.05.

Рисунок 2

Элиминация PLCγ2 частично устраняет медленное вращение, опосредованное Е-селектином, и, следовательно, снижает адгезию лейкоцитов in vivo . (A) Канюли сонной артерии помещали химерным мышам, восстановленным костным мозгом от Plcg2 — / — мышей (n = 3) или мышей WT (n = 3), и подсоединяли к проточным камерам с автоперфузией.Средняя скорость катания нейтрофилов по E-селектину (слева), E-селектину и ICAM-1 (справа) представлена ​​как среднее значение ± SEM. Напряжение сдвига стенки во всех экспериментах с проточной камерой составляло от 5 до 6 дин / см 2 . (B) Смешанные химерные мыши были получены путем инъекции клеток костного мозга мышей LysM-GFP + WT и мышей Plcg2 — / — или мышей Syk — / — смертельно облученным мышам WT. Кумулятивная гистограмма скоростей качения 150 лейкоцитов WT (●), 150 Plcg2 — / — лейкоцитов (▾) и 150 Syk — / — лейкоцитов (○) в воспаленных венулах мышц кремастера смешанных химерных мышей (n = 4), обработанные PTx и моноклональным блокирующим P-селектином антителом (RB40.34). Данные на вставке — это средние значения ± SEM. (C) Количество прикрепленных клеток на квадратный миллиметр в мышечных венулах кремастера мыши. Мышца Cremaster экструдировали через 2 часа после интрамошонковой инъекции 500 нг TNF-α химерным мышам, восстановленным костным мозгом мышей WT или Btk — / — мышей. Пунктирная линия указывает количество адгезивных клеток у мышей WT, обработанных PTx и моноклональным блокирующим E-селектином антителом (9A9). № P <.05.

Адгезию лейкоцитов у химерных мышей, восстановленных либо костным мозгом мышей WT, либо Plcg2 — / — мышей исследовали через 2 часа после инъекции TNF-α.Мыши WT и мыши Plcg2 — / — показали одинаковое количество прикрепленных лейкоцитов (рис. 2С). Блокирование E-селектина у мышей Plcg2 — / — не изменило количество адгезивных клеток по сравнению с мышами WT, получавшими блокирующее антитело E-селектина (1016 ± 161 клеток / мм 2 и 1173 ± 360 клеток / мм 2 соответственно). Мыши WT, получавшие 4 мкг PTx через инъекцию в хвостовую вену перед внутримошонковой инъекцией 500 нг TNF-α, не показали снижения адгезии лейкоцитов по сравнению с мышами WT, получавшими только 500 нг TNF-α (1121 ± 339 клеток / мм 2 и 1226 ± 221 клеток / мм 2 соответственно; Рисунок 2С).После блокирования передачи сигналов Gα i в Plcg2 — / — снижение адгезии лейкоцитов аналогично снижению, наблюдаемому у мышей WT, предварительно обработанных PTx и блокирующим антителом E-селектина (9A9; фигура 2C, пунктирная линия) . Скорости сдвига и диаметры были одинаковыми в разных группах, за исключением гемодинамического вклада в снижение адгезии лейкоцитов (данные не показаны).

Связывание P-селектина с PSGL-1 индуцирует фосфорилирование Nef-ассоциированного фактора 1, который рекрутирует гетеродимер фосфоинозитид-3-OH киназы p38-p110δ и приводит к активации интегрина лейкоцитов. 40 Предварительная обработка мышей специфическим ингибитором PI3Kδ 36 не влияла на скорость вращения нейтрофилов на E-селектине или E-селектине плюс ICAM-1 по сравнению с нейтрофилами от контрольных мышей WT (рис. 3A). Блокирование PI3Kδ в нейтрофилах Plcg2 — / — не влияло на скорость катания только на E-селектине и E-селектине плюс ICAM-1 по сравнению с нейтрофилами Plcg2 — / — , обработанными DMSO (данные не показаны ). Скорость вращения нейтрофилов от мышей WT, предварительно обработанных специфическим ингибитором PI3Kγ 35 , и контрольных мышей WT, получавших только E-селектин, была аналогичной (фиг. 3B).Нейтрофилы от контрольных мышей WT показали снижение скорости вращения на E-селектине плюс ICAM-1 (рис. 3B). Нейтрофилы мышей WT, предварительно обработанные специфическим ингибитором PI3Kγ, показали пониженную скорость вращения на E-селектине плюс ICAM-1, но это снижение было значительно меньше по сравнению с контрольными нейтрофилами WT (рис. 3B). Предварительная обработка мышей Plcg2 — / — специфическим ингибитором PI3Kγ не влияла на скорость катания на E-селектин, но полностью устраняла снижение скорости вращения на E-селектине и ICAM-1 по сравнению со скоростью катания нейтрофилов. от мышей WT, предварительно обработанных ингибитором PI3Kγ (рис. 3B).Чтобы подтвердить эти данные, мы использовали мышей Pik3cg — / — в проточной камере с автоперфузией и в экспериментах по прижизненной микроскопии. Pik3cg — / — нейтрофилы показали меньшее снижение скорости их вращения на E-selectin / ICAM-1 по сравнению с нейтрофилами WT, но медленное вращение, опосредованное E-селектином, не было полностью блокировано (Рисунок 3C). Блокирование PLC (фиг. 3C) или Btk (данные не показаны) у Pik3cg — / — мышей полностью устраняет медленное вращение, опосредованное E-селектином, на E-selectin / ICAM-1.Чтобы изучить роль PI3Kγ в E-селектин-зависимом медленном вращении in vivo, мы выполнили прижизненную микроскопию на смешанных химерных мышах, полученных путем инъекции костного мозга мышей Pik3cg — / — и мышей LysM-GFP + с летальным исходом. облученных мышей WT. После блокирования передачи сигналов, связанных с Gα i , и P-селектина у мышей, обработанных TNF-α, скорость вращения лейкоцитов Pik3cg — / — была значительно выше по сравнению с контрольными лейкоцитами (рис. 3D).

Рисунок 3

Блокирование PI3Kγ в Plcg2 — / — нейтрофилов полностью устраняет медленное вращение, опосредованное E-селектином . (A) Скорость вращения нейтрофилов WT на одном только E-селектине или E-селектине / ICAM-1 мышей WT, предварительно обработанных либо ингибитором PI3Kδ (PI3Kδ-инг.), Либо DMSO. (B) Скорость вращения WT и Plcg2 — / — нейтрофилов только на E-селектине или на E-селектине / ICAM-1 любого из ингибиторов PI3Kγ (PI3Kγ inh.) — или мышей, предварительно обработанных ДМСО. (C) Скорость вращения WT и Pik3cg — / — нейтрофилов на E-селектине или E-селектине / ICAM-1 необработанных мышей или мышей, предварительно обработанных ингибитором PLC. Данные представлены в виде средних значений ± стандартная ошибка среднего для 3 мышей. (D) Смешанные химерные мыши получали путем инъекции клеток костного мозга от мышей Pik3cg — / — и мышей LysM-GFP + WT смертельно облученным мышам WT. Кумулятивная гистограмма скоростей качения 100 GFP + (WT; ●) и 100 GFP ( Pik3cg — / — ; ○) лейкоцитов в воспаленных венулах кремастерной мышцы смешанных химерных мышей (n = 3), обработанных с PTx и моноклональным блокирующим P-селектином антителом (RB40.34). Данные на вставке — это средние значения ± SEM. (E) Количество прикрепленных клеток на квадратный миллиметр в мышечных венулах кремастера мыши. Кремастерную мышцу экстериоризовали через 2 часа после интрамошонковой инъекции 500 нг TNF-α химерным мышам, восстановленным костным мозгом от мышей Pik3cg — / — или мышей WT. Пунктирная линия указывает количество адгезивных клеток у мышей WT, обработанных PTx и моноклональным блокирующим E-селектином антителом (9A9). № P <.05.

Рисунок 3

Блокирование PI3Kγ в нейтрофилах Plcg2 — / — полностью устраняет опосредованное E-селектином медленное вращение .(A) Скорость вращения нейтрофилов WT на одном только E-селектине или E-селектине / ICAM-1 мышей WT, предварительно обработанных либо ингибитором PI3Kδ (PI3Kδ-инг.), Либо DMSO. (B) Скорость вращения WT и Plcg2 — / — нейтрофилов на одном E-селектине или на E-селектине / ICAM-1 либо ингибитора PI3Kγ (PI3Kγ inh.) — или мышей, предварительно обработанных DMSO. (C) Скорость вращения WT и Pik3cg — / — нейтрофилов на E-селектине или E-селектине / ICAM-1 необработанных мышей или мышей, предварительно обработанных ингибитором PLC.Данные представлены в виде средних значений ± стандартная ошибка среднего для 3 мышей. (D) Смешанные химерные мыши получали путем инъекции клеток костного мозга от мышей Pik3cg — / — и мышей LysM-GFP + WT смертельно облученным мышам WT. Кумулятивная гистограмма скоростей качения 100 GFP + (WT; ●) и 100 GFP ( Pik3cg — / — ; ○) лейкоцитов в воспаленных венулах кремастерной мышцы смешанных химерных мышей (n = 3), обработанных с PTx и моноклональным блокирующим P-селектином антителом (RB40.34). Данные на вставке — это средние значения ± SEM. (E) Количество прикрепленных клеток на квадратный миллиметр в мышечных венулах кремастера мыши. Кремастерную мышцу экстериоризовали через 2 часа после интрамошонковой инъекции 500 нг TNF-α химерным мышам, восстановленным костным мозгом от мышей Pik3cg — / — или мышей WT. Пунктирная линия указывает количество адгезивных клеток у мышей WT, обработанных PTx и моноклональным блокирующим E-селектином антителом (9A9). № P <.05.

Адгезию лейкоцитов у химерных мышей, восстановленных либо костным мозгом от Pi3kcg — / — мышей, либо мышей WT, исследовали через 2 часа после инъекции TNF-α.Мыши WT и Pik3cg — / — мышей имели одинаковое количество прикрепленных лейкоцитов (рис. 3E). Блокирование передачи сигналов, связанных с Gα i , у мышей WT, обработанных TNF-α, не изменило количество прикрепленных лейкоцитов (рис. 3E). После блокирования передачи сигналов Gα i у мышей Pi3kcg — / — снижение адгезии лейкоцитов аналогично снижению, наблюдаемому у мышей WT, предварительно обработанных блокирующим антителом E-селектина и PTx (9A9; рис. 3E, пунктирная линия ).Скорости сдвига и диаметры были одинаковыми в разных группах, за исключением гемодинамического вклада в снижение адгезии лейкоцитов (данные не показаны).

Адгезия лейкоцитов к воспаленному эндотелию кремастерной мышцы и рекрутирование нейтрофилов в брюшную полость после инъекции тиогликолата стимулируются E-селектин- и хемокин-зависимыми путями. 39

Чтобы исследовать влияние Btk и PLCγ2 на количество перенесенных лейкоцитов, мы визуализировали экстравазированные лейкоциты в мышце кремастера с помощью косой трансиллюминационной микроскопии в отраженном свете (RLOT). 37 Мыши WT, получавшие 4 мкг PTx через инъекцию в хвостовую вену перед внутримошонковой инъекцией 500 нг TNF-α, не показали снижения экстравазации лейкоцитов (11 ± 1 / 1,5 × 10 4 мкм 2 ) по сравнению с мышами WT, которые сделали не получают обработки PTx (13 ± 2 / 1,5 × 10 4 мкм 2 ; Рисунок 4A). Однако обработка мышей WT PTx и блокирующим антителом E-селектина вызвала значительное снижение экстравазации лейкоцитов (3 ± 1 / 1,5 × 10 4 мкм 2 ) по сравнению с мышами WT, получавшими блокирующий E-селектин. только антитело (11 ± 1/1.5 × 10 4 мкм 2 ; Рисунок 4A). У химерных мышей, восстановленных костным мозгом мышей Plcg2 — / — или Btk — / — мышей, количество экстравазированных лейкоцитов было таким же, как у мышей WT (фиг. 4A). Блокирование E-селектина у мышей Plcg2 — / — или Btk — / — не изменяло количество перенесенных лейкоцитов по сравнению с мышами WT (данные не показаны). В отличие от этого, количество экстравазированных лейкоцитов у химерных мышей, восстановленных с помощью костного мозга мышей Pi3kcg — / — , было значительно снижено по сравнению с мышами WT (рис. 4A).Однако предварительная обработка химерных мышей, реконструированных костным мозгом из Plcg2 — / — мышей, Pi3kcg — / — мышей или Btk — / — мышей с PTx почти устраняла экстравазированные лейкоциты (рисунок 4A) . Репрезентативные RLOT-микроскопические изображения предварительно обработанных PTx химерных мышей, восстановленных костным мозгом мышей WT, Btk — / — мышей или Plcg2 — / — мышей через 2 часа после применения TNF-α показаны на дополнительном рисунке 2A. , B и C соответственно.

Рисунок 4

i -независимое рекрутирование нейтрофилов является дефектным в Btk — / — и Plcg2 — / — мышей . (A) Количество экстравазированных лейкоцитов в кремастерических венулах химерных мышей, обработанных TNF-α, восстановленных костным мозгом мышей WT (n = 4), Btk — / — мышей (n = 4), Pik3cg — / — мышей (n = 3) или Plcg2 — / — мышей (n = 4) на 1.5 × 10 4 мкм 2 Площадь ткани. Измерения проводили через 2 часа после интрамошонковой инъекции TNF-α. Те же группы также были проанализированы после предварительной обработки 4 мкг PTx внутривенно (+ PTx; мыши WT + PTx [n = 4], Btk — / — мышей + PTx [n = 4], Pik3cg — / — мышей + PTx [n = 3], Plcg2 — / — мышей + PTx [n = 4]). В дополнение к этому мы проанализировали мышей WT после предварительной обработки одним блокирующим антителом к ​​E-селектину (+ anti – E-sel.ab [n = 3]) и в комбинации с PTx (мыши WT + анти-E-sel. ab + PTx [n = 4]). (B) Приток нейтрофилов в брюшную полость через 8 часов после инъекции 1 мл 3% тиогликоллата химерным мышам, восстановленным костным мозгом мышей WT (n = 5), Btk — / — мышей (n = 5), или Plcg2 — / — мышей (n = 5). Те же группы были также проанализированы после предварительной обработки 4 мкг PTx внутривенно (+ PTx; мыши WT + PTx [n = 5], Btk — / — мышей + PTx [n = 4] и Plcg2 — / — мышей + PTx [n = 5]).Общее количество нейтрофилов в жидкости перитонеального лаважа определяли с помощью проточной цитометрии и подсчета гемоцитометра. № P <.05.

Рисунок 4

i -независимое рекрутирование нейтрофилов дефектно в Btk — / — и Plcg2 — / — мышей . (A) Количество экстравазированных лейкоцитов в кремастерических венулах химерных мышей, обработанных TNF-α, восстановленных костным мозгом мышей WT (n = 4), Btk — / — мышей (n = 4), Pik3cg — / — мышей (n = 3) или Plcg2 — / — мышей (n = 4) на 1.5 × 10 4 мкм 2 Площадь ткани. Измерения проводили через 2 часа после интрамошонковой инъекции TNF-α. Те же группы также были проанализированы после предварительной обработки 4 мкг PTx внутривенно (+ PTx; мыши WT + PTx [n = 4], Btk — / — мышей + PTx [n = 4], Pik3cg — / — мышей + PTx [n = 3], Plcg2 — / — мышей + PTx [n = 4]). В дополнение к этому мы проанализировали мышей WT после предварительной обработки одним блокирующим антителом к ​​E-селектину (+ anti – E-sel.ab [n = 3]) и в комбинации с PTx (мыши WT + анти-E-sel. ab + PTx [n = 4]). (B) Приток нейтрофилов в брюшную полость через 8 часов после инъекции 1 мл 3% тиогликоллата химерным мышам, восстановленным костным мозгом мышей WT (n = 5), Btk — / — мышей (n = 5), или Plcg2 — / — мышей (n = 5). Те же группы были также проанализированы после предварительной обработки 4 мкг PTx внутривенно (+ PTx; мыши WT + PTx [n = 5], Btk — / — мышей + PTx [n = 4] и Plcg2 — / — мышей + PTx [n = 5]).Общее количество нейтрофилов в жидкости перитонеального лаважа определяли с помощью проточной цитометрии и подсчета гемоцитометра. № P <.05.

Рекрутинг

нейтрофилов в перитонит, индуцированный тиогликолятом, также исследовали на химерных мышах, восстановленных костным мозгом мышей WT, Plcg2 — / — мышей или Btk — / — мышей для блокирования мышей Gα с обработкой Gα или без нее для блокирования мышей PTx или без нее. i сигнализация.В присутствии интактной передачи сигналов GPCR мыши Plcg2 — / — и Btk — / — показали нормальное количество нейтрофилов в брюшной полости через 8 часов после инъекции тиогликоллата (фиг. 4B). Предварительная обработка мышей WT PTx уменьшала рекрутирование нейтрофилов в брюшную полость примерно на 50%. Однако блокирование передачи сигналов Gα i с помощью PTx у мышей Plcg2 — / — и Btk — / — полностью отменило рекрутирование нейтрофилов в брюшную полость после инъекции тиогликоллата (рис. 4B).

Чтобы исследовать, зависит ли наш ранее опубликованный анализ взаимодействия селектина in vitro 7 от напряжения сдвига, мы инкубировали нейтрофилы дикого типа с иммобилизованным E-селектином с напряжением сдвига и без него. Инкубация нейтрофилов дикого типа с E-селектином без напряжения сдвига не вызывала фосфорилирования p38 MAPK, тогда как приложение напряжения сдвига приводило к фосфорилированию p38 MAPK (дополнительная фигура 1A).Чтобы исключить, что интегрин-опосредованная передача сигналов извне-внутрь изучается с помощью анализа вовлечения селектина, мы стимулировали нейтрофилы мышей WT и Itgb2 — / — мышей и исследовали фосфорилирование p38 MAPK. После стимуляции E-селектином, нейтрофилы WT и Itgb2 — / — показали такое же фосфорилирование p38 MAPK, что позволяет предположить, что фосфорилирование p38 MAPK не зависит от интегрина (дополнительная фигура 1B-C).

Вовлечение иммунорецепторов (например, Т-клеточного рецептора, В-клеточного рецептора, GPVI) индуцирует активацию киназ семейства Src, ITAM-содержащих адаптерных белков, киназ семейства Syk и Tec, что, в свою очередь, приводит к фосфорилированию PLCγ2. 20 Роль различных изоформ PI3K в этих сигнальных путях до конца не изучена. 41 Таким образом, мы проверили, приводит ли вовлечение E-selectin к активации Btk, PLCγ2 и PI3K. Стимуляция нейтрофилов WT с помощью E-селектина в условиях напряжения сдвига индуцировала фосфорилирование Btk (фиг. 5A), PLCγ2 (Tyr1217), Akt как мишени для PI3K и p38 MAPK (фиг. 5B). Чтобы продемонстрировать, что эти молекулы расположены ниже Syk, нейтрофилы Syk — / — стимулировали E-селектином в условиях напряжения сдвига.В Syk — / — нейтрофилы фосфорилирование Btk (фиг. 5A), PLCγ2 (Tyr1217), Akt как мишень для PI3K и p38 MAPK (фиг. 5B) отсутствовали, что позволяет предположить, что Syk находится выше Btk, PLCγ2, и PI3Kγ.

Рисунок 5

Включение E-селектина индуцирует фосфорилирование Btk, PLCγ2 и PI3K . Нейтрофилы костного мозга высевали на непокрытые (нестимулированные) или покрытые Е-селектином лунки на 10 минут, а затем готовили лизаты.(A) Лизаты подвергали иммунопреципитации анти-Btk с последующим иммуноблоттингом (IB) с общим антителом к ​​фосфотирозину (PY; 4G10). (B) Лизаты подвергали иммуноблоттингу с использованием антител к фосфорилированному PLCγ2 (фосфо-PLCγ2 [Tyr1217]), общему PLCγ2 (n = 3), фосфорилированному Akt (n = 3), общему Akt (n = 3), фосфорилированному p38 MAPK (фосфо- p38) или всего p38 (n = 3).

Рисунок 5

Включение E-селектина индуцирует фосфорилирование Btk, PLCγ2 и PI3K . Нейтрофилы костного мозга высевали на непокрытые (нестимулированные) или покрытые Е-селектином лунки на 10 минут, а затем готовили лизаты.(A) Лизаты подвергали иммунопреципитации анти-Btk с последующим иммуноблоттингом (IB) с общим антителом к ​​фосфотирозину (PY; 4G10). (B) Лизаты подвергали иммуноблоттингу с использованием антител к фосфорилированному PLCγ2 (фосфо-PLCγ2 [Tyr1217]), общему PLCγ2 (n = 3), фосфорилированному Akt (n = 3), общему Akt (n = 3), фосфорилированному p38 MAPK (фосфо- p38) или всего p38 (n = 3).

Наши данные in vivo показывают, что Btk регулирует PLCγ2- и PI3Kγ-зависимые ветви пути, ведущего к активации β 2 -интегрина.Следовательно, мы проверили, требуется ли Btk для последующей передачи сигналов Syk после вовлечения E-selectin. Как показано ранее, стимуляция нейтрофилов дикого типа с помощью Е-селектина индуцировала фосфорилирование PLCγ2 (Tyr1217), Akt и p38 MAPK (фиг. 6A). Стимуляция Btk — / — нейтрофилов E-селектином не вызвала фосфорилирования PLCγ2 (Tyr1217), Akt или p38 MAPK (рис. 6A), что позволяет предположить, что Btk необходим для активации PLCγ2- и PI3Kγ-зависимых путей. . Фосфорилирование Syk в нейтрофилах Btk — / — не изменилось после вовлечения E-селектина (фигура 6B).

Рисунок 6

Btk необходим для активации PLCγ2- и PI3Kγ-зависимых путей . Нейтрофилы костного мозга высевали на непокрытые (нестимулированные) или покрытые Е-селектином лунки на 10 минут, а затем готовили лизаты. (A) Лизаты подвергали иммуноблоттингу с использованием антител к фосфорилированному PLCγ2 (фосфо-PLCγ2 [Tyr1217]), общему PLCγ2 (n = 3), фосфорилированному Akt (n = 3), общему Akt (n = 3), фосфорилированному MAPK (фосфо-p38 ) или всего p38 (n = 3).(B) Лизаты подвергали иммунопреципитации анти-Syk с последующим иммуноблоттингом (IB) с общим антителом к ​​фосфотирозину (PY; 4G10). (C) Нейтрофилы костного мозга высевали на непокрытые (нестимулированные) или покрытые E-селектином лунки на 10 минут, а затем определяли внутриклеточные уровни IP 3 с использованием анализа конкурентного связывания. * P <0,05 по сравнению с другими группами.

Рисунок 6

Btk необходим для активации PLCγ2- и PI3Kγ-зависимых путей .Нейтрофилы костного мозга высевали на непокрытые (нестимулированные) или покрытые Е-селектином лунки на 10 минут, а затем готовили лизаты. (A) Лизаты подвергали иммуноблоттингу с использованием антител к фосфорилированному PLCγ2 (фосфо-PLCγ2 [Tyr1217]), общему PLCγ2 (n = 3), фосфорилированному Akt (n = 3), общему Akt (n = 3), фосфорилированному MAPK (фосфо-p38 ) или всего p38 (n = 3). (B) Лизаты подвергали иммунопреципитации анти-Syk с последующим иммуноблоттингом (IB) с общим антителом к ​​фосфотирозину (PY; 4G10).(C) Нейтрофилы костного мозга высевали на непокрытые (нестимулированные) или покрытые E-селектином лунки на 10 минут, а затем определяли внутриклеточные уровни IP 3 с использованием анализа конкурентного связывания. * P <0,05 по сравнению с другими группами.

Фосфорилирование PLCγ2 строго не связано с его ферментативной активностью. 20 Чтобы показать, что активность PLCγ2 повышается после вовлечения E-селектина, мы измерили концентрацию второго мессенджера IP 3 , который продуцируется активированным PLC, в нестимулированном и стимулированном WT, Btk — / — и Plcg2 — / — нейтрофилов.После активации нейтрофилов дикого типа с помощью Е-селектина внутриклеточная концентрация IP 3 увеличивалась по сравнению с нестимулированными нейтрофилами дикого типа (рис. 6С). Однако не удалось обнаружить увеличения уровней IP 3 в нейтрофилах Btk — / — и Plcg2 — / — , стимулированных E-селектином (фигура 6C).

Связывание селектинов с их гликоконъюгатными лигандами на нейтрофилах индуцирует фосфорилирование киназ семейства Src, 7,40,42 ITAM-содержащих адаптерных белков, 7 и Syk, 7,42 , что приводит к активации интегрина, 8 медленная прокатка, 8,43 и адгезия. 9 Однако сигнальный путь, связывающий Syk с β 2 -интегринами, все еще оставался неизвестным. Здесь мы показываем, что киназа Btk семейства Tec незаменима для медленного катания, опосредованного E-selectin. После вовлечения E-селектина Btk фосфорилируется Syk-зависимым образом, и сигнальный путь ниже Btk делится на PLCγ2- и PI3Kγ-зависимые ветви, которые оба регулируют медленное вращение, опосредованное β 2 -интегрином (дополнительный рисунок 3). . Устранение Btk блокировало Gα i -независимое рекрутирование нейтрофилов в воспаленную мышцу кремастера и брюшную полость, что демонстрирует физиологическую значимость наших результатов.

Здесь мы определили, что Btk выполняет ключевую функцию по регулированию скорости перекатывания и Gα i -независимого рекрутирования нейтрофилов в воспаленную ткань. Нейтрофилы экспрессируют киназы семейства Tec Btk, Tec и Bmx, 12 , которые могут непосредственно активироваться киназами семейства Src. 12 В сигнальном пути, опосредованном E-селектином, Btk располагается ниже Syk, поскольку фосфорилирование Btk отсутствует в нейтрофилах Syk — / — после вовлечения E-селектина.В некоторых сигнальных путях, 12 генерация PIP3 с помощью PI3K необходима для рекрутирования Btk на плазматическую мембрану и последующей активации. Поскольку мы использовали специфические ингибиторы PI3K (PI3Kγ и PI3Kδ), мы не можем исключить возможность того, что генерация PIP3 необходима для активации Btk, поскольку другие изоформы PI3K могут продуцировать PIP3. Альтернативно, Btk может рекрутироваться и активироваться лейкоцитарным белком 76 кДа, содержащим домен Src homology-2 (SLP76), который способен связывать и активировать киназы семейства Tec. 44 Ранее было продемонстрировано, что мыши Btk — / — демонстрируют пониженное рекрутирование нейтрофилов в воспаленную ткань. 19 Btk также участвует в индуцированном fMLP производстве супероксид-анионов, стимуляции адгезии и хемотаксисе, 18 , но не в вызванной хемокинами остановке лейкоцитов in vivo (см. «Киназа семейства Tec Btk необходима для E-селектина. — опосредованное медленное вращение и Gα i -независимая адгезия, но не для индуцированного хемокинами ареста in vivo »).

Mangla et al. 19 продемонстрировали, что Btk — / — мышей снизили рекрутирование нейтрофилов в брюшную полость после инъекции тиогликолятов по сравнению с мышами WT. В присутствии интактной передачи сигналов, связанной с Gα i , мы не смогли обнаружить дефектное рекрутирование нейтрофилов у мышей Btk — / — через 8 часов после инъекции тиогликоллата. Однако у мышей Btk — / — полностью устранено Gα i -независимое рекрутирование нейтрофилов.Разные результаты двух исследований, вероятно, можно объяснить использованием разных стимулов. Можно предположить, что Mangla et al 19 использовали более сильный стимул, поскольку они наблюдали примерно в 5 раз больше нейтрофилов в брюшной полости, чем мы (∼7,5 × 10 6 на мышь против 1,5 × 10 6 на человека. мышь, соответственно), но концентрация тиогликоллата не указывалась.

Ниже Btk сигнальный путь E-селектина делится на PLCγ2- и PI3Kγ-зависимые пути, тогда как блокирование пути PLCγ2 частично отменяет медленное вращение, опосредованное E-селектином, но полностью устраняет экстравазацию лейкоцитов и рекрутирование нейтрофилов в воспаленную ткань.Эти данные вместе с ранее опубликованным исследованием 25 , показывающим, что нейтрофилы от Plcg2 — / — мышей мигрируют и нормально реагируют на хемоаттрактанты, демонстрируют, что PLCγ2 может обладать различными и уникальными функциями в различных сигнальных путях. Элиминация PLCγ2 полностью ингибирует интегрин-опосредованную передачу сигналов снаружи-внутрь, 25 , тогда как медленное вращение, опосредованное E-selectin, затрагивается лишь частично. Фосфорилирование PLCγ2 отсутствует в нейтрофилах мышей Syk — / — и Btk — / — , что позволяет предположить, что эти молекулы находятся выше PLCγ2.В передаче сигналов BCR Syk способствует активации PLCγ2 с помощью Btk. 44 В соответствии с предполагаемой ролью этих тирозинкиназ в активации PLCγ2, медленное вращение, опосредованное E-селектином, было отменено у мышей Btk — / — (рис. 1B) и Syk — / — мышей (Рисунок 2B). 8 Наблюдаемая критическая роль PLCγ2 в продукции IP 3 и медленное вращение, опосредованное E-selectin, указывает на важную нисходящую роль кальций и кальций-зависимых сигнальных молекул.Действительно, повышенные уровни внутриклеточного кальция наблюдались после стимуляции нейтрофилов Е-селектином. 45 Кальций-зависимые сигнальные молекулы, вероятно, являются классическими и новыми изоформами протеинкиназы C и факторами обмена семейства RasGRP, которые действуют на различные ГТФазы семейства RAS, включая Ras и Rap1. 46 Киндлины и талин напрямую взаимодействуют с хвостами субъединиц интегрина-β и регулируют их сродство. 47,48 Роль этих молекул в опосредованной селектином активации β 2 -интегрина и медленном вращении должна быть рассмотрена в дальнейших исследованиях.

Интегрин-опосредованный сигнальный путь снаружи внутрь имеет сходство с путем PSGL-1 – Fgr-DAP12 / FcRγ, но есть также некоторые различия. 7 До сих пор неизвестно, опосредуется ли медленное вращение только с помощью передачи сигналов наизнанку. Используя нейтрофилы Itgb2, , — / — в тесте вовлечения селектина, мы смогли продемонстрировать, что фосфорилирование p38 MAPK не зависит от интегрин-опосредованной передачи сигналов извне-внутрь.Однако мы не можем полностью исключить, что медленное вращение в проточной камере и эксперименты с прижизненной микроскопией не зависят от интегрин-опосредованной передачи сигналов извне-внутрь.

PI3Kδ и PI3Kγ проявляют частично повторяющиеся функции в привлечении лейкоцитов, и было показано, что обе изоформы регулируются в зависимости от времени и стимула. 32 В этом исследовании мы демонстрируем, что PI3Kγ, но не PI3Kδ, находится ниже Btk.Однако наши данные не исключают, что другие изоформы PI3K также могут участвовать в продукции PIP3 и последующем рекрутировании Btk на плазматическую мембрану после вовлечения E-selectin. Это согласуется с ранее опубликованным исследованием, которое продемонстрировало, что связывание P-selectin с PSGL-1 индуцирует активацию PI3Kδ, который участвует в индуцированной P-селектином активации интегрина. 40 Поскольку мембраносвязанный Btk участвует в синтезе фосфоинозитидов, 49 остается неясным, приводит ли его киназная функция к активации последующих молекул и / или необходим ли его вклад в продукцию PIP2 для генерации второго мессенджера активированным PI3Kγ и PLCγ2 (дополнительный рисунок 3).Liu et al. 32 продемонстрировали, что удаление PI3Kγ не влияло на скорость катания лейкоцитов в посткапиллярных венулах кремастерной мышцы после инъекции TNF-α. 32 В этой модели скорость катания лейкоцитов регулируется с помощью передачи сигналов E-selectin, P-selectin и Gα i . 8 Поскольку Liu et al. 32 не блокируют передачу сигналов P-selectin и Gα i , эти данные согласуются с нашими данными проточной камеры, показывающими, что только медленное вращение, запускаемое E-selectin, зависит от PI3Kγ.После инъекции TNF-α у Pik3cg — / — мышей и мышей WT обнаруживается одинаковое количество адгезивных клеток в посткапиллярных венулах кремастерной мышцы, но количество трансмигрированных клеток значительно снижается в Pi3kcg — / — мышей (рис. 4А). Эти данные согласуются с опубликованными данными, 32 и предполагают, что PI3Kγ также участвует в трансмиграции. Взятые вместе, роль и универсальность различных изоформ PI3K в привлечении лейкоцитов очень сложна и требует дальнейших исследований для выяснения их различных функций.

Наши эксперименты in vitro и in vivo предоставляют доказательства релевантной роли Btk в регуляции медленного вращения, опосредованного E-selectin. Кроме того, мы демонстрируем, что ниже Btk сигнальный путь делится на PLCγ2- и PI3Kγ-зависимые пути, которые оба регулируют медленное вращение, опосредованное β 2 -integrin. Устранение Btk или PLCγ2 блокировало Gα i -независимое рекрутирование нейтрофилов в брюшную полость, демонстрируя физиологическую значимость наших результатов.Необходимы дальнейшие исследования, чтобы прояснить, как PLCγ2 и PI3Kγ регулируют E-selectin-индуцированное β 2 -integrin-опосредованное медленное вращение по ICAM-1.

Онлайн-версия этой статьи содержит дополнение с данными.

Расходы на публикацию этой статьи были частично оплачены за счет оплаты страницы. Таким образом, исключительно для того, чтобы указать на этот факт, данная статья помечена как «реклама» в соответствии с разделом 18 USC 1734.

Мы благодарим Корнелию Бруннер за мышей Btk — / — и доктора Барри Волицки за предоставление мышиного антитела 9A9, блокирующего Е-селектин.

Это исследование было поддержано грантами Немецкого исследовательского фонда (AZ 428 / 3-1 до AZ), Междисциплинарного центра клинических исследований (IZKF; Мюнстер, Германия) и Национальных институтов здравоохранения (NIH; R01 AI079087 — D .W.).

Национальные институты здравоохранения

Вклад: H.M. проводил эксперименты и помогал анализировать данные; В КАЧЕСТВЕ. проведенные эксперименты; H.V.A., E.H. и D.W. помог разработать исследование и интерпретировать результаты; К.Л. помог разработать исследование и интерпретировать результаты, а также отредактировал рукопись; и А.З. разработал исследование, провел множество экспериментов, проанализировал результаты и написал статью.

Раскрытие информации о конфликте интересов: авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Для корреспонденции: Александр Зарбок, Отделение анестезиологии и реанимации, Университет Мюнстера, Albert-Schweitzer Str 33, 48149 Мюнстер, Германия; электронная почта: [email protected]

NED TALK 2021: BTKi AE — Онкология

Закрыть панель дополнительной информации

Подкаст ЭпизодПодкаст Эпизод

Послушайте Бет Фэйман, PhD, MSN, APRN-BC, AOCN, предоставит ориентированный на медперсонал обзор ингибиторов BTK в лечении ХЛЛ и других В-клеточных злокачественных новообразований, включая самые последние доказательства, представленные на крупных онкологических конференциях.

Бет Фэйман, доктор философии, MSN, APRN-BC, AOCN
Программный директор Зарегистрированные медсестры: 0,25 Контактные часы медсестер Помощники врача: максимум 0.25 часов кредитов CME категории I AAPA Выпущено: 23 июля 2021 г. Истекло: 22 июля 2022 г. Закрыть панель дополнительной информации

Подкаст ЭпизодПодкаст Эпизод

Послушайте Эми Гудрич, RN, MSN, CRNP-AC, предоставьте ориентированный на медсестер обзор управления некоторыми из наиболее распространенных нежелательных явлений, связанных с ингибиторами BTK

Эми Гудрич, RN, MSN, CRNP-AC Зарегистрированные медсестры: 0.25 часов приема медсестер Помощники врача: максимум 0,25 часа зачетных единиц AAPA категории I CME Выпущено: 23 июля 2021 г. Истекло: 22 июля 2022 г. Закрыть панель дополнительной информации

Подкаст ЭпизодПодкаст Эпизод

Послушайте Эми Гудрич, RN, MSN, CRNP-AC, предоставив ориентированный на медсестер обзор управления серьезными побочными эффектами, связанными с терапией ингибитором BTK.

Эми Гудрич, RN, MSN, CRNP-AC Зарегистрированные медсестры: 0,25 Контактные часы медсестер Помощники врача: максимум 0,25 часа зачетных единиц AAPA категории I CME Выпущено: 27 июля 2021 г. Истекло: 26 июля 2022 г. Закрыть панель дополнительной информации

Подкаст ЭпизодПодкаст Эпизод

Послушайте Сандру Э.Куртин, доктор философии, ANP-C, AOCN, обсуждает управление взаимодействиями лекарство-лекарство и лекарство-еда для минимизации нежелательных явлений у пациентов, получающих ингибиторы BTK.

Сандра Э. Куртин, доктор философии, ANP-C, AOCN Зарегистрированные медсестры: 0,25 Контактные часы медсестер Помощники врача: максимум 0.25 часов кредитов CME категории I AAPA Выпущено: 27 июля 2021 г. Истекло: 26 июля 2022 г. Закрыть панель дополнительной информации

Подкаст ЭпизодПодкаст Эпизод

Послушайте Сандру Куртин, PhD, ANP-C, AOCN, обсудите стратегии, которые следует использовать пациентам, чтобы избежать побочных эффектов при лечении ингибиторами BTK.

Сандра Э. Куртин, доктор философии, ANP-C, AOCN Зарегистрированные медсестры: 0,25 Контактные часы медсестер Помощники врача: максимум 0,25 часа зачетных единиц AAPA категории I CME Выпущено: 27 июля 2021 г. Истекло: 26 июля 2022 г.

Поликлональное антитело BTK с высоким сродством и специфичностью E-AB-60350 от Elabscience.com

Приготовление образцов белка

1. Экстракция белка

1) Для образца ткани
a. Возьмите образцы, тщательно промойте ткань предварительно охлажденным PBS (0,01 M, pH = 7,4) (№ по каталогу E-BC-R187), чтобы удалить с поверхности кровь и внутренний мусор.
г. Взвесить и раздробить ткань, добавить буфер для лизиса RIPA в соответствующем соотношении (каталожный номер E-BC-R327) (добавить 10 мкл PMSF и 10 мкл Na 3 VO 4 на каждый 1 мл лизиса RIPA) и гомогенизировать ткань.
Рекомендуется гомогенизировать в соответствии с соотношением массы ткани: объем RIPA = 3:10. Например, добавьте 1 мл буфера для лизиса RIPA к 0,3 г образца ткани, удельный объем можно отрегулировать в соответствии с требованиями эксперимента.
г. После гомогенизации встряхнуть и лизировать на льду в течение 30 мин. Затем обработайте образец ультразвуком в течение 1 мин (в условиях водяной бани со льдом) с обработкой ультразвуком 2 с и интервалами 2 с, чтобы клетки полностью лизисили и снизили вязкость образца.
г. Центрифуга при 12000 об / мин в течение 10 минут при 4 ℃.
e. Возьмите супернатант и измерьте концентрацию белка, указанную в шаге 2.

2) Для образца ячейки
a. Соберите клетки, тщательно промойте их предварительно охлажденным PBS (0,01 M, pH = 7,4), чтобы удалить среду (обычно рекомендуется промыть 3 раза).
г. Добавьте соответствующее соотношение лизатного буфера RIPA (10 мкл PMSF и 10 мкл Na 3 VO 4 в каждом 1 мл RIPA Lysis) и лизируйте на льду в течение 30 мин.
Рекомендуется добавить 0,1 мл буфера для лизиса RIPA в каждую лунку 6-луночного планшета (содержание белка в разных клетках может различаться, и объем добавляемого лизата может быть соответствующим образом отрегулирован).
г. Обработайте образец ультразвуком в течение 1 мин (в условиях бани с ледяной водой) с обработкой ультразвуком 2 с и интервалами 2 с, чтобы клетки полностью лизировались и уменьшили вязкость образца.
г. Центрифуга при 12000 об / мин в течение 10 минут при 4 ℃.
e. Возьмите супернатант и измерьте концентрацию белка, указанную в шаге 2.

2. Измерение концентрации белка
С помощью метода BCA (см. Инструкции набора для колориметрического анализа общего белка (№ по каталогу E-BC-K318)).

3. Кипячение образцов
Отрегулируйте концентрацию белка с помощью буфера PBS. Добавьте 5 × буфер для загрузки SDS (№ по каталогу E-BC-R288) с соотношением образца белка: 5 × буфер для загрузки SDS = 4: 1 и кипятите смесь в течение 10 мин. Центрифуга при 12000 об / мин в течение 2 мин и собрать супернатант.Денатурированный белок можно использовать в экспериментах вестерн-блоттинга или хранить при -20 или -80 ° C.

Примечание: Рекомендуется, чтобы общее загружаемое количество белка тестируемого образца составляло около 50 мкг в каждой лунке. Постарайтесь сделать загрузочный объем каждого образца близким к 10 мкл.

Электрофорез

1. В соответствии с молекулярной массой целевого белка приготовьте разделительный гель 0% . Добавьте тестируемый образец в каждую лунку и добавьте 5 мкл предварительно окрашенного белкового маркера (№ по каталогу E-BC-R273) в зарезервированную лунку, чтобы проверить целевую молекулярную массу и степень мембранного переноса.Добавьте буфер для электрофореза (№ по каталогу E-BC-R331) и запустите электрофорез.

2. Электрофорез при 80 В, когда образцы находятся в геле для укладки, затем преобразование в 120 В, когда синий перетекает в разделяющий гель. Время электрофореза составляет около 2–3 ч до достижения бромфеноловым синим дна геля.

Переносная мембрана

1. Выберите мембрану PVDF (№ по каталогу E-BC-R266) с размером пор мкм в соответствии с молекулярной массой целевого белка.Замочите мембрану PVDF в метаноле на 1 минуту, чтобы активировать ее, а затем погрузите мембрану PVDF в трансмембранный буфер (каталожный номер E-BC-R333), фильтровальная бумага и волокнистый мат также должны быть пропитаны трансмембранным буфером для использования.

2. Следуйте инструкциям производителя системы переноса для влажного, полусухого или сухого переноса.

Инкубация антител

1. Пропитайте мембрану PVDF буфером TBST (№ по каталогу E-BC-R335), содержащим 5% сухого обезжиренного молока в качестве блокирующего буфера, и заблокируйте мембрану при комнатной температуре на .

2. В соответствии с рекомендуемым коэффициентом разбавления первичных антител используйте буфер TBST, содержащий 5% сухого обезжиренного молока, чтобы разбавить BTK-антитело при , замочить мембрану PVDF в рабочем растворе первичных антител, инкубировать в течение ночи при 4. ℃ и осторожно встряхните.

3. Промойте мембрану PVDF буфером TBST для .

4. В соответствии с рекомендуемым коэффициентом разбавления вторичных антител используйте буферный раствор TBST, содержащий 2% сухого обезжиренного молока, для разбавления козьего анти-кроличьего IgG (H + L) (конъюгированного с пероксидазой / HRP) (каталожный номер E-AB- 1003) по номеру .Инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 ч на шейкере.

5. Промойте мембрану PVDF буфером TBST для .

Обнаружение

1. Смесь A и B в наборе для обнаружения отличных хемилюминесцентных субстратов (№ по каталогу E-BC-R347) в соотношении 1: 1 в качестве рабочего раствора.

2. Извлеките мембрану из ПВДФ из буфера TBST и удалите жидкость фильтровальной бумагой. Уложите мембрану PVDF на детекторную машину, непрерывно добавляйте рабочий раствор ECL на мембрану PVDF, выпустите пузырь и определите результат.

Обновлено: 05.12.2021 — 13:53

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *